Автореферат (1144257), страница 5
Текст из файла (страница 5)
5 В и Г). Наконец, в экспериментах pull-down было продемонстрировано,что как рекомбинантный, так и эндогенный рецептор специфично связывается схолестерин-агарозой (рис. 5 Д). Таким образом, было показано, что белоклипидные взаимодействия, а именно, связывание с холестерином, определяютвнутриклеточную локализацию S1R, и, вероятно, могут играть важную роль вфункционировании рецептора сигма-1.Известно, что определенные контактные области ЭР, включая МАМы,характеризуются особым липидным составом и представлены липиднымирафтовыми микродоменами.
Для прямых биофизических исследований in vitroбыла разработана методика реконструкции рекомбинантного рецептор сигма-1человека в модельные бислойные мембраны. Рекомбинантный флуоресцентномеченый рецептор использовался для встраивания в липосомы и получения«гигантских» одномембранных липосом (ГОЛ).
Как видно из полученныхрезультатов (рис. 6, верхняя панель), сигма-1 рецептор равномерно распределенна поверхности ГОЛ, полученных из липида ДОФХ. Для получения липосомдругого липидного состава использовались смеси ДОФХ с холестерином. Вданном случае наблюдалась кластеризация рецептора в определенных областяхлипидного бислоя и соответствующее уменьшение интенсивности плотностидиффузно-распределенного рецептора.18Рис. 5.
S1R локализуется в особых областях ЭР (МАМ), что определяется егоспособностью связываться с холестерином. А. Флуоресцентная микроскопия, показывающаявнутриклеточную локализацию S1R (S1R-GFP и маркер ЭР mCherry-ER). Б. Коэффициенты колокализации Мандерса для рецептора дикого типа и мутантов по сайту связывания схолестерином и mCherry-ER. В. Результаты биохимического фракционирования мембран ираспределение рецептор дикого типа и мутанта R7ER8E (RR). Г. Количественный анализВестерн-блота на рис.
В. Д. Связывание эндогенного и рекомбинантного S1R с холестеринагарозой.Рис. 6. Реконструкция рецептора сигма-1 в «гигантские» одномембранные липосомыразличного липидного состава. А. Верхняя панель: реконструкция рецептора в липосомы,полученные из липида ДОФХ. Нижняя панель: реконструкция рецептора в липосомы,содержащие 20% холестерин (S1R-Alexa555, NBD-PC).
Б. FRAP-измерения коэффициентовдиффузии метки NBD-PC в липосомах различного состава в присутствии и отсутствии S1R.Опираясь на полученные ранее биохимические данные по связываниюрецептора с холестерином, было предположено, что кластеризация рецептораприводит также к соответствующему перераспределению холестерина в составеГОЛ и формированию холестерин-богатых липидных микродоменов. Дляопределения коэффициентов диффузии использовался метод FRAP.
Приувеличении концентрации холестерина наблюдалось уменьшение коэффициентадиффузии, что соответствует увеличению вязкости мембраны в присутствии19холестерина (рис. 6 Б). Встраивание рецептора сигма-1 также приводило кпонижению коэффициента диффузии мембранных липидов, поскольку белокпредставляет собой препятствие для свободной диффузии метки. В соответствиис исходным предположением о сигма-1-опосредованном перераспределениимембранных липидов, встраивание рецептора в холестерин-содержащиелипосомы приводило к обратному эффекту, то есть наблюдалось увеличениекоэффициента диффузии метки (в данном эксперименте изучались области,свободные от кластеризованного рецептора).
Таким образом, был сделан вывод,что рецептор сигма-1 в модельной системе кластеризуется в определенныхобластях липидной мембраны, секвестируя холестерин, что приводит ксоответствующему уменьшению эффективной концентрации холестерина всвободном от S1R бислое и увеличению эффективной концентрации холестеринав S1R-богатых липидных кластерах.На клеточной линии HEK293T было показано, что сверхэкспрессиярецептора приводит к увеличению контактной длины ЭР-митохондрии (рис. 7 А).В модельных нейрональных культурах было продемонстрировано, что мутантнаяформа белка R7ER8E не может компенсировать утраченную функцию рецепторадикого типа по поддержанию синаптических контактов in vitro (рис.
7 Б).Полученные данные позволяют выдвинуть обоснованную гипотезу о том, что S1Rявляется организатором и стабилизатором рафтовых микродоменов ЭР.Рис. 7. Функциональное значение рецептора сигма-1. А. Увеличение контактной длинымежду ЭР и митохондриями при сверхэкспрессия S1R. Б. Функционально-активный рецептордикого типа необходим для поддержания синаптических контактов в модельнойгиппокампальной культуре нейронов.В з а к л ю ч е н и и г л а в ы формулируется гипотеза о S1R-опосредованноммеханизме регулирования ионных каналов через белок-липид-белковыевзаимодействия. Последовательность событий в присутствии рецептора сигма-1 вмембране может быть графически проиллюстрирована на рис.
8. Рафторганизующая функция рецептора может оказывать прямое и опосредованноевлияние на локализацию, функцию и позиционирование рафтовых и нерафтовыхбелков,что,вцелом,позволяетобъяснитьэкспериментальнозадокументированную «многофункциональность» S1R.20Рис. 8. S1R в роли организатора истабилизатора липидных рафтов ЭР.А. Вслучае,есликонцентрацияхолестерина в мембране недостаточна длявозникновенияфазовогоразделения,фосфолипиды,сфингомиелиныихолестерин гомогенно распределены вбислое.
Б. В присутствии S1R наблюдаетсякластеризация рецептора и холестерина,что приводит к увеличению локальной(эффективной) концентрации холестерина.В. Увеличение локальной концентрациихолестерина приводит к фазовому переходуи разделению фаз на Lo (рафтовую) и Ld(нерафтовую).Существующие литературные данные показывают, что отсутствие S1Rприводит к глобальным перестройкам в мембранном составе на клеточномуровне.Рецепторсигма-1функционирует,по-видимому,засчетперераспределения холестерина (и, возможно, других типов липидов) междусвободной от холестерина жидкой липидной фазой и рафтовой фазой ЭР,стабилизируя последнюю, тем самым дифференциально и разнонаправленорегулируя мембранные каналы и рецепторы.Выводы1.
Согласно экспериментально установленной с помощью методарентгеноструктурного анализа структуре С-концевой области атаксина-3,полиглутаминовый тракт находится в двух конформациях: свободной петли(кристалл С1) и альфа-спирали (кристалл С2).2. Структурной особенностью полиглутаминового тракта в альфаспиральной конформации является то, что она стабилизирована двумя сетямиводородных связей: между атомами пептидной группы i и i + 4 остатков и междукарбокси- и аминогруппами боковых цепей остатков глутамина; при этомводородные связи между боковыми цепями ориентированы параллельно осиальфа-спирали.3.
Вновь разработанное пептоидное соединение HNP1 связывается с Nконцевой областью хантингтина с микромолярной аффинностью (Kd=20 мкМ).4. В микромолярных концентрациях HNP1 ингибирует агрегациюмутантного хантингтина в клетках линии HEK293T (снижение в 2,2 раза,p<0.0001). HNP1 является нейропротектором в кортико-стриатальной моделиболезни Хантингтона, восстанавливая плотность дендритных шипиков нейронов.5.
Реконструированный S1R равномерно распределен на поверхности«гигантских» одномембранных липосом, полученных из липида ДОФХ, икластеризуется в двухкомпонентной липидной смеси, содержащей холестерин.6. С помощью метода FRAP показано, что встраивание рецептора вхолестерин-содержащие «гигантские» липосомы приводит к увеличениюдиффузии метки (увеличение коэффициента диффузии в 1,5 раза, p=0.055), чтосвидетельствует о S1R-опосредованном перераспределении холестерина вмодельных мембранах.217. С помощью методов флуоресцентной микроскопии и биохимическогофракционирования показано, что рецептор сигма-1 локализуется в особыхобластях эндоплазматического ретикулума, что обусловлено наличиемаминокислотныхCARC-последовательностей,связывающиххолестерин.Мутации по критическим аминокислотным остаткам приводят к неправильномупозиционированию рецептора в клетке.8.
Сверхэкспрессия рецептора на клеточном уровне приводит к увеличениюконтактной длины между ЭР и митохондриями в клетках линии HEK293T.Функционально-активный рецептор необходим для поддержания нормальнойплотности синаптических контактов в гиппокампальных культурах нейронов invitro.Заключение. В настоящей работе с помощью спектра биофизических,структурных и функциональных исследований был решен ряд фундаментальныхпроблем, касающихся структурной организации белков, вовлеченных в развитиенейродегенеративных заболеваний. C помощью метода рентгеноструктурногоанализа определена структура С-концевой области атаксина-3, включающейполиГ тракт, с наиболее высоким доступным на настоящий момент разрешениемв 2 Å.
Определенная вторичная структура подтвердила полученные ранееструктурные данные о белке хантингтине, а также предоставила новые данные овнутри- и межмолекулярных взаимодействиях полиГ тракта. Из пептоиднойбиблиотеки было идентифицировано новое соединение HNP1, связывающееся сN-концевой областью хантингтина и обладающее антиагрегационными инейропротекторными свойствами in vitro. Была сформулирована гипотеза о белоклипид-белковом механизме функционирования S1R через стабилизациюлипидных микродоменов, и впервые были представлены экспериментальныебиофизические данные в пользу того, что рецептор сигма-1 является рафтовыморганизатором ЭР.Список публикаций по теме исследованияСтатьи1.
Пчицкая Е.И., Жемков В.А., Безпрозванный И.Б. Динамические микротрубочки приболезни Альцгеймера: связь с патологией дендритных шипиков // Биохимия. – 2018. –Т. 83(9). – С. 1343–1350. DOI 10.1134/S0320972518090087.2. Zhemkov V.A., Kulminskaya A.A., Bezprozvanny I.B., Kim M.
The 2.2-Angstromresolution crystal structure of the carboxy-terminal region of ataxin-3 // FEBS Open Bio. – 2016. –Т. 3, No 6. – С. 168–178. DOI: 10.1002/2211-5463.12029.3. Большакова А.В., Куканова Е.О., Гайнуллина А.Н., Жемков В.А., Корбан С.А.,Безпрозванный И.Б. Рецептор сигма-1 как потенциальная фармакологическая мишень прилечении нейропатологии // Научно-технические ведомости Cанкт-Петербургскогогосударственногополитехнического университета.
Физико-математические науки. – 2016. –Т. 1(237). – С. 48-65. DOI: 10.5862/JPM.237.5.Материалы конференций4. Жемков В.А. Корбан С.А., , Кульминская А.А., Безпрозванный И.Б., Ким. Белоклипидные взаимодействия рецептора сигма-1 человека // XIX Зимняя молодежная школа побиофизике и молекулярной биологии ФГБУ «ПИЯФ» НИЦ «Курчатовский институт». Сборниктезисов. – 2018.5.
Корбан С.А., Жемков В.А., Кульминская А.А., Безпрозванный И.Б., Ким М.В.. Cигма1 рецептор – новая мишень при нейропатологиях. Cтруктура и функция // Acta Naturae,Спецвыпуск. Международная научная конференция по биоорганической химии «XII чтения22памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова» и VIII российский симпозиум «Белки ипептиды». М.: Издательство «Перо».
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
