Автореферат (1144257), страница 3
Текст из файла (страница 3)
На этом этапе осуществлялсяпоиск дифракционных максимумов hkl , определение сингонии и параметровэлементарной ячейки кристалла. На этапе интегрирования определялиинтегральную интенсивность дифракционных максимумов на дифрактограммахдля расчета модулей структурных факторов Fhkl . Определение фаз осуществлялиметодом молекулярного замещения с использованием структуры MBP(PDB ID: 1ANF). Для определения положения поисковой молекулы вэлементарной ячейке кристалла использовался поиск в пространстве Паттерсона(PHASER).
При этом рассчитывались карты межатомных векторов Патерсона поамплитудам структурных факторов:912 Fhkl cos 2 (hu kv lw) — (1) синтез Паттерсона.V h, k ,lПравильное положение молекулы в элементарной ячейке кристалласоответствует максимальному перекрыванию функций для поисковой и искомойструктур. На практике, проблема поиска решается путем нахождения максимумовфункций вращения и трансляция молекулы в элементарной ячейке кристалла.Функция вращения описывается следующим образом:P(u , v, w) Rot ( R) Pobs (u) Pcalc ( R u)d 3u — (2), где(V )Pobs ( u) — функция Паттерсона для экспериментального набора данных,Pcalc ( R u) — функция Паттерсона для поисковой модели, R — матрицавращения, u = (u,v,w) .
На втором этапе осуществляется трансляционный поиск вэлементарной ячейке кристалла:Tr (T ) Pobs (r ) Pcalc (r - T)d 3r — (3) функция трансляции(V )T — вектор переноса (трансляции).После определения фаз становится возможным расчет распределенияэлектронной плотности по формуле ( x, y , z ) Fhkl exp(ihkl )exp(2 i( hx ky lz )) — (4).h,k ,lПомимо этого, на каждом этапе перестроения и уточнения моделирассчитывается дифференциальная карта электронной плотности, для выявленияошибок модели:1 ( x, y, z ) Fobs Fcalc exp icalc exp(2 i (hx ky lz )) — (5).V h , k ,lДля расчета исключенных (OMIT) карт электронной плотности в расчет невключались атомы участка, для которого рассчитывалось распределение.Модели строили независимо для каждого из кристаллов и для каждоймолекулы в составе элементарной ячейки кристалла (в случае кристалла С2) впрограмме Coot.
На этапе уточнения структуры такие параметры, как координатыатомов, занятости, тепловые B-факторы варьируются с целью достижениямаксимального соответствия между экспериментальной и расчетнойдифракционными картинами. Количественной мерой этого соответствия являютсяR/Rfree факторы. Уточнение проводили в программе Refmac5, расчет геометрииструктуры в программе MOLPROBITY.Коэффициент корреляции в прямом пространстве (ККПП) для каждогоостатка (i) рассчитывался по следующей формуле: ( ( x, y, z )obs,i ( x , y, z )obs, i ) ( ( x , y , z )obs,i ( x, y, z )obs,i )ККПП i x , y, zx , y, z22 1/2, где( ( ( x, y, z )obs,i ( x , y, z )obs, i ) ( ( x, y, z )obs,i ( x , y, z )obs,i ) )x , y, zx , y, zobs ,i ( x, y, z ) — экспериментальное значение электронной плотности для iго остатка в точке x, y, z, рассчитанное по формуле (4) с использованием10экспериментально определенных амплитуд структурных факторов и фаз модели;calc,i ( x, y, z ) — расчетное значение электронной плотности для i-го остатка вточке x, y, z с использованием рассчитанных амплитуд структурных факторов ифаз модели.
OMIT-карты электронной плотности и расчет коэффициентакорреляции в прямом пространстве были использованы для валидацииполученной модели.Для идентификации пептоида HNP1 была синтезирована библиотекасоединений. Для синтеза пептоидной библиотеки был применен комбинаторныйметод «смешения и разделения», присоединение пептоидного остатка на каждомэтапе включало реакцию ацетилирования и SN2-замещения. Для идентификациисоединений, связывающихся с N17 использовался N-концевой пептидхантингтина bio-MATLEKLMKAFESLKSFQQQ. Идентификация пептоидовосновывалась на той особенности библиотеки, что один шарик носителя содержитодно уникальное пептоидное соединение. Связанный bio-N20 детектировали спомощью стрептавидин-Qdot.
Голубые шарики, имеющие красную каймуквантовых точек, отбирались вручную и секвенировались для определенияпоследовательностей пептоидов. Одним из идентифицированных соединений былпептоид HNP1. Константа диссоциации была определена методом изотермальнойтитрационной калориметрии. Для анализа анти-агрегационных свойств пептоидаклетки линии HEK293T трансфецировали конструкцией, кодирующей Htt-82QGFP, в культуральную среду добавляли пептоид HNP1. Спустя 48 часов послетрансфекции клетки фиксировали и анализировали с помощью конфокальногомикроскопа. Для каждой концентрации подсчитывался процент клеток,содержащих ядерные или цитоплазматические включения Htt относительно GFPпозитивных клеток. Для анализа нейропротекторных свойств HNP1использовались первичные кортико-стриатальные культуры, полученные отмышей дикого типа или линии YAC128.
На 7-ой день культивирования (DIV) ккультурам добавляли пептоид HNP1. Нейроны стриатума (DIV 19)визуализировали путем окраски антителами против белка DARPP32.Морфологию синаптических контактов анализировали в программе NeuronStudio.Для определения внутриклеточной локализации S1R и колокализации смаркером ЭР, клетки линии HEK293T были ко-трансфецированы флуоресцентномечеными белками S1R-GFP (WT, R7ER8E, ΔR7–R8, 9–10insAAAA,9–10insGGGG, W9LW11L) и mCherry-ER.
Биохимическое фракционированиемембран осуществляли следующим образом: клетки HEK239T лизировали вгипотоническом буфере, после чего осаждали митохондриальную фракцию.Цитозольотделялиотмикросомальнойфракцииспомощьюультрацентрифугирования.Митохондрииотделялиотмитохондрийассоциированных мембран с помощью центрифугирования в градиенте перколла.Для изучения прямого связывания эндогенного и рекомбинантного S1R схолестерином применялся метод pull-down с использованием холестерин-агарозы.ДлябиофизическихэкспериментоврекомбинантныйS1Rбылреконструирован в модельные бислойные мембраны.
В работе использовалисьследующие липиды: 1,2-диолеил-sn-глицеро-3-фосфохолин 18:1 (ДОФХ),сфингомиелины головного мозга (СМ), холестерин, 16:0-06:0 NBD-PC (NBD-ФХ).11Рекомбинатный рецептор был экспрессирован в бакуловирусной системеэкспрессии, выделен и очищен до гомогенного состояния. Белок был ковалентномечен с помощью флуорофора AlexaFluor 555. Протеолипосомы были полученыпутем солюбилизации липидных смесей вместе с S1R-AlexaFluor555 ипоследующим удалением детергента с помощью гидрофобной смолы BioBeads.Для получения «гигантских» однослойных липосом (ГОЛ) протеолипосомынаносили на предметные стекла, покрытые тонким слоем высушенной 1%агарозы, высушивали и регидрировали.
ГОЛ формировались при 42° С в течениечаса и анализировались с помощью лазерной сканирующей конфокальноймикроскопии. Для FRAP-измерений коэффициентов диффузии в ГОЛ небольшуюобласть радиусом r выжигали коротким высокоинтенсивным лазернымимпульсом, после чего измеряли восстановление интенсивности флуоресценции.Кривые восстановления аппроксимировали экспоненциальной функцией дляопределения 1/2 . Коэффициент диффузии определяли, пользуясь формулой длядвумерной диффузии 1/2 R 2 / 4 D . Для анализа контактной длины между ЭР имитохондриями применяли метод просвечивающей электронной микроскопии.Для визуализации ЭР клетки трансфецировали плазмидами HRP-ER (контроль) иS1R-Apex2 (сверхэкспрессия), соответственно.
Для анализа синаптическихконтактов в модельной гиппокампальной культуре нейронов первичные культурыполучали от мышей дикого типа и линии S1RKO. Клетки ко-трансдуцировалилентивирусными конструкциями для сверхэкспрессии S1R дикого типа илиR7ER8E для сверхэкспрессии мутантного S1R (DIV 7), и конструкцией TdTomatoдля визуализации синапсов. Клетки анализировали на DIV 14 с помощьюконфокальной микроскопии. Синапсы классифицировали в программеNeuronStudio.В третьей и четвертой главах работы представлены результаты,полученные в настоящем диссертационном исследовании, и их обсуждение.П е р в ы й п а р а г р а ф посвящен определению и описанию кристаллическойструктуры С-концевого фрагмента атаксина-3 (Atxn3-C), который былэкспрессирован в виде белка слияния с мальтозо-связывающим белком MBP.Белок был выделен и очищен до гомогенного состояния с помощью аффиннойхроматографии на амилозной смоле и гель-фильтрации.
Кристаллы белка былиполучены в двух кристаллизационных условиях. Полученные кристаллы (С1 иС2) были использованы для получения картины рентгеновской дифракции.Полученные дифрактограммы использовались для вычисления модулейструктурных факторов рассеяния. Начальная фазовая информация была полученаметодом молекулярного замещения, в качестве поисковой модели использоваласьмолекула MBP. Финальные параметры R и Rfree для уточненных моделейсоставили, соответственно, 0,207/0,225 (C1), 0,202/0,249 (C2) (Табл. 1). КристаллыС1 и С2 имели разные пространственные группы (C1 — P1, C2 — P1411),параметры элементарной ячейки и упаковку молекул в кристалле (табл.
1).Структура С-концевой области также была различной. ПолиГ тракт в кристаллеС1 находился в конформации случайной петли (рис. 1 А), в то время как тот жеучасток в кристалле С2 частично экранирован от растворителя симметричносвязанными молекулами MBP (x-1, y, z) и (x-1, y, z-1) и находится в конформации12альфа-спирали (рис. 1 Б). Кристаллическая структура этого региона былаопределена с разрешением 2,2 Å.
Финальные координаты моделей были принятыи депонированы в международную базу данных белковых структур PDB(C1: 4YS9, C2: 4WTH).Наибольший интерес представляет, очевидно, структура полиглутаминовойобласти атаксина-3 (рис. 2). Было показано, что этот регион вовлечен вформирование как меж-, так и внутримолекулярных взаимодействий.Межмолекулярные взаимодействия представлены связями с расположеннымирядом остатками MBP: карбоксильными группами остатков аспарагиновой иглутаминовойкислоты(Q387(NE2)–E22(OE2),Q389(NE2)–D95(OD2),Q394(NE2)–D236(OD2)),аминогруппамилизина(Q390(OE2)–K295(NZ),Q392(O)–Y176(OH), карбоксильными группами полипептидного остова(Q390(NE2)–D296(O)/K295(O); Q393(NE2)–T237(O) и координированнымимолекулами воды (Q391, Q392, Q385, Q386) (рис.
2 Г, Д, Е, Ж).Наиболее интересные данные о структуре полиГ спирали были получены,пожалуй, при анализе внутримолекулярных взаимодействий полиГ. АльфаспиральнаяконформацияAtxn3-Cдополнительностабилизированавнутримолекулярными водородными связями, формируемыми между остаткамиглутамина и ориентированными преимущественно параллельно оси альфаспирали (рис. 2, вкладки А, Б, В, а также табл. 2).Рис. 1. Структуры Atxn3-C вкристаллахС1иС2.А.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
