Автореферат (1144257), страница 4
Текст из файла (страница 4)
СтруктураAtxn3-CвкристаллеС1.Б. СтруктураAtxn3-C в кристалле С2. MBPпоказан в виде поверхностисерогоцвета.N-концеваяфланкирующаяпоследовательность — зеленым,полиГтракт — оранжевым, С-концеваяфланкирующаяпоследовательность — синим цветами.Восемь из 13 остатков вовлечены в формирование прямыхвнутриспиральных водородных связей между i и i + 4 остатками (в четырехслучаях) и i и i + 3 остатками (в одном случае) (рис.
2 и табл. 2). Помимо этихпрямых взаимодействий между остатками глутамина, остаток Q385взаимодействует с неглутаминовыми остатками i - 4 (Y381) и i + 3 (K388) черезводородные связи с координированной молекулой воды. Лишь один остаток Q392не вовлечен во внутриспиральные взаимодействия, взаимодействуя с Y175 MBP.13Рис. 2. Структура полиГспирали в кристалле С2.Участок полиГ в составеMBP-Atxn3-Cпоказаноранжевым цветом. Nконцеваяфланкирующаяпоследовательность показана зеленым, а остаткиMBP — серым, координированныемолекулыводы — голубым цветами.Межмолекулярныеводородные связи показанычерными,внутримолекулярные — краснымипунктирнымилиниями.Картыэлектроннойплотности2Fo–FcдляAtxn3-C показаны в видесинихизоповерхностей(1,0 σ).Накрасныхвкладках детально показанывнутриспиральныевзаимодействиямеждуостатками глутамина (ссоответствующейOMITкартойэлектроннойплотности 0,9 σ): (А) Y381–Q385–K388;(Б) Q387–Q391и Q390–Q394; (В) Q386–Q389–Q393–Q397.
На синих вкладках детально показаны межмолекулярныевзаимодействиямеждуостатками глутамина и остатками MBP с соответствующей OMIT-картой (0,9 σ): (Г) Q392–Y176, Q393–T237, Q387–E22; (Д) Q390–K295/K295/D296; (Е) Q394–D236; и (Ж) Q389–D95.Табл. 1. Кристаллографическиеданные,параметрысъемкикристаллов,статистические характеристики уточнения кристаллических структур.Кристалл C2 (4WTH)Кристалл С1 (4YS9)ИсточникДлина волны (Å)Температура (K)ДетекторПространственная группаa, b, c (Å)α, β, γ (°)Область разрешения (Å)Количество независимыхотраженийR symСбор дифракционных данныхСинхротрон APS, линия 19 ID (Аргонн, США)0,9795100Quantum 315rP1P1411Параметры элементарной ячейки49,01, 59,77, 77,7959,68, 59,68, 135,1790,00, 89,99, 87,5090,00, 90,00, 90,0038,74–2,25 (2,33–2,25)*37,65–2,00 (2,05–2,00)*39 11531 8610,047 (0,917)0,053 (0,566)14Среднее значение Ι/σΙПолнота набора (%)Избыточность набораданныхОбласть разрешения (Å)Количество отражений,общий набор данныхКоличество отражений,тестовый набор данныхRworkRfreeБелкаЛиганда/ионовВодыСредние тепловые Bфакторы (Å2)БелкаЛиганда/ионовВодыДлин связей (Å)Углов связей (°)15,7 (1,2)94,0 (76,1)1,9 (1,8)23,2 (1,2)85,2 (58,0)1,9 (1,3)Уточнение структуры38,74–2,25 (2,33–2,25)37158 (2105)37,65–2,00 (2,05–2,00)30210 (2205)1980 (113)1607 (124)0,202 (0,541)0,249 (0,591)0,207 (0,221)0.225 (0,327)Количество неводородных атомов629529757 (Zn), 46 (MAL)4 (Zn), 23 (MAL)1559044,745,461,7 (Zn), 33,4 (MAL)59,8 (Zn), 30,5 (MAL)40,039,4Среднеквадратичные отклонения0,0070,0061,1311,043Статистика Рамачадрана98,1296,60Наиболеепредпочтительная область(%)Разрешенная область (%)1,752,88Запрещенная область (%)0,130,52* – значения в скобках соответствуют сфере наиболее высокого разрешения.Табл.
2. Внутриспиральные водородные связи между остатками глутамина врегионе полиГ кристалла С2.А.к.о.А.к.о.Расстояние, ÅА.к.о.А.к.о.Расстояние, ÅY381 (OH)Q385 (OE1)Y381–HOH; 2,6; Q389 (NE2)Q393 (OE1) 2,7HOH–Q385: 2,8Q385 (NE2)K388 (NZ)Q385–HOH: 2,9; Q390 (NE2)Q394 (OE1) 3,0HOH–K388: 2,8Q387 (NE2)Q391 (OE1)3,5Q393 (NE2)Q397 (OE1) 4,0Q386 (NE2)Q389 (OE1)2,9Две кристаллические структуры показали, что полиГ тракт находится в двухконформациях: свободной петли и альфа-спирали, что согласуется с ранееполученными кристаллическими структурами первого экзона хантингтина. Висследованиях Htt было показано, что полиГ тракт способен принимать целыйспектр различных переходных между спиралью и петлей структур.Конформационная гетерогенность, наблюдавшаяся для кристаллов Htt, проявиласебя как два типа кристаллов Atxn3-С.
Наша гипотеза состоит в том, чтополиглутаминовый тракт Htt и Atxn3 находится в конформационном равновесиимежду альфа-спиральной структурой и структурой случайной петли.15Далее приводится сравнение установленной экспериментальной структурыс другими работами, посвященными исследованиям последовательностей полиГ.Внутримолекулярная стабилизация структуры полиГ была описана в рядетеоретических работ, но впервые наблюдалась экспериментально. В модели,предложенной Lathrop и коллегами, боковые остатки глутамина вовлечены вформирование межостаточных водородных связей между остатками i и i + 4.Кристаллическая структура полиГ в кристалле С2 показывает, что остаткиглутамина способны формировать водородные связи как с i + 4, так и с i + 3остатками.
Cогласно экспериментально определенной кристаллическойструктуре, остатки глутамина более склонны к гомотипическим Q-Qвзаимодействиям, формируя большое количество межостаточных водородныхсвязей. Таким образом, полиГ участок в альфа-спиральной конформациипредставляется инертным с точки зрения белок-белковых взаимодействий.В з а к л ю ч е н и и п а р а г р а ф а , автором рассматривается структура полиГв контексте нейродегенеративных заболеваний. В структуре MBP-Atxn3-Cостатки глутамина формируют множественные координированные водородныесвязи вдоль полиглутаминовой спирали.
М. Перутц был первым, кто предложилмодель олигомерной бета-складчатой структуры полиГ, известную, как полярнаязастежка. Согласно этой модели, Q–Q взаимодействия стабилизируют бетаскладчатую конформацию полиглутаминовых агрегатов. Структура Atxn3-C имодель полярной застежки демонстрируют, как Q–Q взаимодействиястабилизируют вторичные белковые структуры. Эффект стабилизации альфаспиральной структуры полиглутамина, по-видимому, будет гораздо менеевыражен в присутствие сольватирующих молекул воды. Однако, в тех случаях,когда эффект влияния растворителя будет менее выражен, как, например, приувеличении локальной концентрации белка вследствие экспансии триплета илипри аккумуляции полиглутаминовых фрагментов, эффект Q–Q стабилизацииможет приводить к формированию полиглутаминовых агрегатов.
Исключениерастворителя может приводить к ассоциации глутамина, посредством как внутритак и межмолекулярных взаимодействий, осложняя протеасомную деградациюагрегатов подобных олигомеров и ускоряя макро-агрегацию полиглутаминсодержащих белков.В о в т о р о м п а р а г р а ф е т р е т ь е й г л а в ы описывается синтезпептоидной библиотеки и идентификация нового пептоидного соединения HNP1,которое специфически связывается с N-концевой областью хантингтина. Напервом этапе была синтезирована библиотека, насчитывающая порядка 60000уникальных соединений (рис. 3 А).С использованием пептида bio-N20 в качестве мишени, былоидентифицировано и синтезировано пептоидное соединение HNP1, специфическисвязывающееся с N-концевой областью хантингтина (рис.
3 Б). Было показано,что HNP1 связывается с рекомбинантным хантингтином MBP-Htt-17Q и MBP-Htt45Q, но не с MBP (рис. 3 В). Методом изотермической титрационнойкалориметрии была определена константа диссоциации пептоида и N17(Kd=20 мкМ).16Рис. 3. Идентификация пептоида HNP1, специфически связывающегося с N-концевойобластью хантингтина. А. Общая химическая структура пептоидной библиотеки.Б. Химическая структура HNP1. В. Связывания пептоида HNP1 с рекомбинантнымхантингтином MBP-Htt-17Q и -45Q.Для анализа антиагрегационных свойств пептоида HNP1 in vitro в клеткахлинии HEK293T был экспрессирован флуоресцентно-меченый хантингтин Htt82Q-GFP. Было показано, что добавление HNP1 концентрационно-зависимоуменьшает количество клеток, содержащих ядерные или цитоплазматическиеагрегаты мутантного хантингтина Htt-82Q-GFP (рис. 4 А).
В заключении, намодельной первичной кортико-стриатальной культуре нейронов, полученной отмышей линии YAC128, экспрессирующих мутантный хантингтин, было показано,что добавление соединения оказывает нейропротекторный эффект истабилизирует синаптические контакты нейронов стриатума (рис. 4 Б).Рис.
4. Агрегация флуоресцентно-меченого хантингтина in vitro и нейропротекторныесвойства пептоида HNP1. А. и Б. Процент клеток содержащих ядерные илицитоплазматические агрегаты Htt82Q-GFP в присутствие соответствующих концентрацийHNP1. В. Изображения дендритов клеток стриатума (окраска антителами против DARPP32) иколичественный анализ линейной плотности дендритных шипиков в культурах дикого типа иYAC128 в присутствии и отсутствии HNP1.В о б с у ж д е н и и полученных результатов рассматриваются свойства,которые делают пептоиды привлекательными с фармакологической точки зрения.Пептоиды рядом преимуществ по сравнению с традиционными пептиднымисоединениями.
В частности, они (1) обладают более высоким разнообразием по17сравнению с пептидами; (2) вследствие наличия модифицированной пептиднойсвязи не способны расщепляться протеазами, что выражается в более высокойстабильности пептоидов in vivo; (3) короткие пептоиды являютсямембранопроницаемыми. Таким образом, полученные в настоящей работесоединения-прототипы могут служить основой для дальнейшей разработкипептоидных препаратов в сфере нейродегенерации в целом, и, в частности,терапии БХ.Т р е т и й п а р а г р а ф т р е т ь е й г л а в ы посвящен изучению белоклипидных взаимодействий рецептора сигма-1 человека. В культуре клетокHEK293T было показано, что S1R-GFP локализуется в особых областях ЭР(рис.
5 А). С помощью биохимического фракционирования было показано, чторецептор дикого типа находится, преимущественно, в составе ассоциированных смитохондриями мембран (МАМ) (рис. 5 В и Г — коэффициенты распределениямежду МАМ и микросомальной фракциями). С помощью биоинформатическогоанализа первичной аминокислотной последовательности рецептора, в составетрансмембранного участка был идентифицирован предполагаемый сайтсвязывания холестерина, представляющий собой CARC-последовательность видаK/R-X(1–5)–Y/F/W-X(1–5)–L/V (H2N–MQWAVGRRWAWAALLLAVAAVLTQVVWLWLGT…, подчеркнут трансмембранный участок). Мутации по даннымаминокислотным остаткам (R7ER8E, ΔR7–R8, W9LW11L, 9–10insGGGG,9–10insAAAA) приводили к перераспределению рецептора из МАМ в тубулярныйЭР (рис. 5 Б). С помощью биохимического фракционирования мембран былопоказано, что мутант R7ER8E находится как в МАМ, так и в тубулярном ЭР(рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
