Автореферат (1144257), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Полученные в настоящей работе результаты используются вкурсах лекций кафедры «Медицинская физика» ИФНиТ СПбПУ: «Основырентгеноструктурного анализа белков в нейробиологии», «Прикладные проблемынейробиологии».Личный вклад автора. Основные результаты диссертационной работыполучены лично автором с использованием экспериментальной базы ЛабораторииМолекулярной нейродегенерации СПбПУ (Санкт-Петербург, Россия) и лаб.
И.Б.Безпрозванного, Юго-Западный медицинский центр Университета Техаса (UTSWMedical Center, Даллас, США). Планирование экспериментов и обсуждениеполученных результатов проводилось совместно с научными руководителями:д.б.н. И.Б. Безпрозванным и Dr. MeeWhi Kim. Автор принимал непосредственноеучастие в выполнении представленных в работе экспериментов, если не указанообратное: эксперименты на нейрональных культурах были выполнены асп. ЛМНН.А. Красковской и сотрудником UTSW Medical Center Dr. Daniel Ryskamp.Пептоидная библиотека была синтезирована сотрудником СПбГУ к.х.н.
П.Р.Голубевым. Эксперименты по кристаллизации MBP-Atxn3-C проводилисьсовместно с Dr. MeeWhi Kim. Сбор дифракционных данных осуществлялся приподдержке сотрудников лаборатории структурной биологии UTSW Medical Centerи синхротрона Advanced Photon Source (Аргонн, США). Обработка данных,подготовка результатов к публикациям проводилась лично автором, текстыпубликаций подготавливались совместно с соавторами.Апробация работы. Результаты диссертационной работы былипредставлены на следующих российских и международных конференциях: The18th International Conference on Calcium Binding Proteins and Calcium Function inHealth and Disease, 30 июня–4 июля 2013 г, г. Кируна, Швеция), Всероссийскойконференции «Системно-технические решения проблем визуализации внейродегенерации» (23–25 октября 2013 г, г.
Санкт-Петербург, Россия), XLIIнаучно-практической конференции с международным участием «Неделя наукиСПбГПУ» (2–7 декабря 2013 г, г. Санкт-Петербург, Россия), Calcium 2014: Frombasics to bedside, (3–5 июля 2014 г, г. Стокгольм, Швеция), совместном семинареЛаборатории молекулярной нейродегенерации и лаборатории А. Аперии (3 июля2014 г., Каролинский Институт, г. Стокгольм, Швеция), Международной научнойконференции Science of the Future (17–20 сентября 2014 г, г. Санкт-Петербург,Россия), XVII Зимней молодежной школе ПИЯФ по биофизике и молекулярнойбиологии (29 февраля–5 марта 2015 г, п. Рощино, Россия), The 12th InternationalConference on Alzheimer’s and Parkinson’s Diseases (18–22 марта 2015 г, г. Ницца,Франция), V съезде биофизиков России (4–10 октября 2015 г, Ростов-на-Дону,Россия), II Конференции молодых ученых и специалистов ПИЯФ «КМУС-2015»(11–13 ноября 2015 г, г. Гатчина, Россия), Форуме с международным участием«XLIV Неделя Науки СПбПУ» (30 ноября–5 декабря 2015 г, г.
Санкт-Петербург,Россия), Gordon Research Conferences: Neurobiology of Brain Disorders (7–12августа 2016 г, г. Жирона, Испания), Форуме с международным участием «XLVНеделя Науки СПбПУ» (14–19 ноября 2016 г., г. Санкт-Петербург, Россия).7Основные результаты по теме диссертационной работы опубликованы трехнаучных статьях в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, а также вматериалах научных конференций (16 тезисов).Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит извведения, обзора литературы, экспериментальной части, включающейметодологическую часть и результаты исследования, обсуждения полученныхрезультатов, заключения, выводов и списка литературы, включающего276 источников. Работа изложена на 147 листах машинописного текста, включает26 рисунков и 3 таблицы.Содержание работыВовведенииобосновываетсяактуальностьдиссертационногоисследования, ставится цель и соответствующие задачи работы.
Обосновананаучно-практическая значимость диссертационной работы, а также методы иметодология исследования, формулируются основные положения, выносимые назащиту. Описана апробация работы и личный вклада автора, а также приведенахарактеристика структуры и объема диссертации.В первой главе диссертации рассмотрена актуальная литература по темеисследования. П е р в ы й п а р а г р а ф посвящен описанию структуры и функциибелка атаксина-3, мутации в гене которого приводят к возникновению аутосомнодоминантно наследуемого заболевания — спиномозжечковой атаксии 3-го типа.Рассмотрена функция белка в клетке и описана доменная организация атаксина-3.Поскольку объектом настоящего исследования являлось установлениекристаллической структуры С-концевой области, содержащей полиглутаминовыйтракт, отдельное внимание уделено структурным и биофизическимисследованиям гомополимерных полиГ-последовательностей.
Несмотря нафундаментальнуюзначимостьструктурнойинформацииополиГ,кристаллические структуры доступны лишь для хантингтина с 17 и 36 остаткамиполиглутамина и полиГ пептида в комплексе с анти-полиГ антителом. Взаключении параграфа приводится методологический раздел, посвященныйрентгеноструктурному анализу белков. В о в т о р о м п а р а г р а ф е описываетсяструктурная организация хантингтина, экспансия триплета CAG в гене которогоприводит к развитию БХ. Рассматриваются возможные механизмы токсичностиполиГ тракта на молекулярно-клеточном уровне. Отдельное внимание посвященоструктурно-функциональным взаимоотношениям полиГ тракта Htt ифланкирующих его последовательностей: N-концевой области (N17) иполипролиновому тракту.
Рассматриваются имеющиеся на настоящий моментподходы, направленные на предотвращение агрегации мутантного Htt, одним изкоторых может являться поиск веществ или соединений, связывающихся с N17.Ранее было показано, что домен N17 является про-агрегационным, игомоолигомеризация этого домена является первым этапом агрегации Htt. Ранеена клеточных и мышиных моделях БХ была показана эффективность применениявыработанных против N17 анти- и интрател. Таким образом, делается вывод, чтоподход с использованием N17 в качестве терапевтической мишени являетсяобоснованным. В т р е т ь е м п а р а г р а ф е рассматриваются молекулярнобиологические и структурные характеристики рецептора сигма-1 человека.
Этот8трансмембранный белок эндоплазматического ретикулума связывает спектрсоединений, многие из которых в настоящее время широко используются вклинической практике. На клеточных и мышиных моделях ряда НДЗ былапоказана эффективность фармакологической активации рецептора с применениемселективных сигма-агонистов. Однако, механизм функционирования S1Rостается неизвестным несмотря на многолетние исследования. Считается, что S1Rфункционирует как белок-«шаперон» или дополнительная регуляторнаясубъединица в условиях клеточного стресса, регулируя широкий спектр ионныхканалов и рецепторов на плазматической мембране и мембранах ЭР.
Ряд статейуказывает на то, что, для нормального функционирования рецептора сигма-1значимую роль могут играть белок-липидные взаимодействия. Таким образом,актуальным направлением дальнейших исследований является выяснениебиофизических основ взаимодействия рецептора с липидами, что до этоговремени не было осуществлено в научной практике. В заключении параграфарассматриваются биофизические подходы для изучения мембранных белков вискусственных бислойных мембранах, липидный состав биологических мембрани структурные характеристики основных классов липидов.Во второй главе описана экспериментальная часть работы: материалы иметоды, использованные в настоящем исследовании.Генетические конструкции для гетерологической экспрессии белков и геныслияния с GFP были получены стандартными методами молекулярногоклонирования.
Белки с точечными мутациями были получены с помощью сайтнаправленного мутагенеза. Белки MBP, MBP-Htt-17Q, MBP-Htt48Q, MBP-Htt82Q, MBP-Htt-138Q, MBP-Atxn3-C были получены в экспрессионной системеE. coli и очищены с помощью аффинной хроматографии на амилозной смоле. Длякристаллизационных экспериментов MBP-Atxn3-C был дополнительно очищен спомощью гель-фильтрационной хроматографии. Рекомбинатный 6*His-S1R былполучен в бакуловирусной системе экспрессии, выделен и очищен с помощьюметалл-хелатной хроматографии на Ni-агарозе, ионообменной хроматографии(monoQ) и гель-фильтрации.MBP-Atxn3-C был закристаллизован методом диффузии водяных паров вмодификации «висячая капля». Кристаллы были заморожены в жидком азоте,сбор дифракционных данных осуществляли на линии 19 ID синхротронаAdvanced Photon Source (Аргонн, США). Первичную обработку дифракционныхизображений проводили в программе HKL2000.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
