Автореферат (1144257)
Текст из файла
На правах рукописиЖЕМКОВ Владимир АндреевичСТРУКТУРНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ БЕЛКОВ,ВОВЛЕЧЁННЫХ В НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫЕПРОЦЕССЫ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИЕ ОСОБЕННОСТИ ИХМЕЖМОЛЕКУЛЯРНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙСпециальность 03.01.02 – БиофизикаАВТОРЕФЕРАТдиссертации на соискание ученой степеникандидата физико-математических наукСанкт-Петербург2018Работа выполнена в лаборатории молекулярной нейродегенерации Федеральногогосударственного автономного образовательного учреждениявысшегообразования «Санкт-Петербургский политехнический университет ПетраВеликого», г.
Санкт-Петербург.Научный руководитель:Безпрозваннный Илья Борисович,доктор биологических наукОфициальные оппоненты: Самыгина Валерия Ролановна,кандидат физико-матетематических наук,ФНИЦ «Кристаллография и фотоника» РАН,НИЦ «Курчатовский институт»,старший научный сотрудникКрылов Борис Владимирович,доктор биологических наук, профессор, ФГБУН«Институт физиологии им. И.П. Павлова» РАН,заведующий лабораториейВедущаяорганизация:Федеральноегосударственноебюджетноеобразовательное учреждение высшего образования «Санкт-Петербургскийгосударственный университет», 199034, г.
Санкт-Петербург, Университетскаянабережная, д. 7-9.Защита состоится « 19 » декабря 2018 г. в 16-00 часов на заседаниидиссертационного совета Д 212.229.25 при Федеральном государственномавтономном образовательном учреждении высшего образования «СанктПетербургский политехнический университет Петра Великого» (ФГАОУ ВО«СПбПУ») по адресу: 194021, г. Санкт-Петербург, ул. Хлопина, д. 11.С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГАОУ ВО«Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого» по адресу:195251, г. Санкт-Петербург, Политехническая ул., д. 29, а также на сайте ФГАОУВО «СПбПУ»: http://www.spbstu.ru.Автореферат разослан «__» ________ 2018 г.Ученый секретарьдиссертационного совета,доктор биологических наук:Линькова НатальяСергеевна3Общая характеристика работыАктуальность работы.
Нейродегенеративные заболевания (НДЗ)представляют собой совокупность различных по своей природе болезней ЦНС,поражающих различные отделы головного мозга. Многие наследственные НДЗотносят к т.н. конформационным болезням - группе дегенеративных заболеваний,в основе которых лежит нарушение трехмерной пространственной укладкиопределенных белковых молекул. Несмотря на многолетние исследованиямеханизмов различных НДЗ, таких как болезни Альцгеймера, Хантингтона,Паркинсона, и поиск эффективных терапевтических подходов для их лечения,подавляющее большинство из них остаются неизлечимыми, а пациентам можетбыть предложено только симптоматическое лечение.
Остаются плохо изученнымиструктурные особенности и молекулярные механизмы функционирования иактивации как нормальных, так и мутантных форм белков, вовлеченных внейродегенеративные процессы. Для максимально полного пониманиямеханизмов функционирования белков, лежащих в основе молекулярногопатогенеза заболеваний, необходимо применение комплексных исследований,сочетающих биофизические, биохимические и структурные подходы.Примером такого научного исследования может служить данная работа, гдев качестве объектов для изучения были выбраны следующие белки: атаксин-3,хантингтин и рецептор сигма-1.А т а к с и н - 3 (ataxin-3, Atxn3), экспансия в гене которого приводит квозникновению спиномозжечковой атаксии 3-го типа, относится к белкам,содержащим гомополимерные полиглутаминовые последовательности (полиГ).Имеющаяся до настоящего момента структурная информация о полиГпоследовательности ограничена лишь кристаллическими структурами первогоэкзона хантингтина (Htt) с 17 и 36 повторами глутамина, а также кристаллическойструктурой полиглутаминового декапептида (10Г) в комплексе с анти-полиГантителом.
Однако, структура первого экзона хантингтина была определена сразрешением лишь 3.0–3.6 Å и осложнена присутствием множественныхконформаций полиГ в кристалле, что затруднило определение положенийбоковых цепей аминокислотных остатков. Таким образом, важным продолжениемструктурных исследований белков, содержащих полиГ-последовательности,является определение кристаллической структуры полиГ высокого разрешения.Подобные мутации экспансии триплета в гене х а н т и н г т и н а (Htt)приводят к развитию болезни Хантингтона (БХ).
Ряд структурных ибиофизических работ, объектом которых служил первый экзон хантингтина,продемонстрировали, что фланкирующие полиглутамин домены модулируютструктуру полиГ тракта, его способность к агрегации и цитотоксичность. Вчастности, ранее было показано, что N-концевая последовательность,непосредственно предшествующая полиГ тракту (N17), является проагрегационной. Согласно этой гипотезе, амфипатическая спираль N17хантингтина гомоолигомеризуется, что, в свою очередь, приводит к сближению иувеличению локальной концентрации полиГ и последующей полиГопосредованной агрегации. Таким образом, перспективным подходом длябудущей разработки веществ-прототипов лекарственных средств при БХ является4поиск небольших химических соединений, направленных на блокирование N17зависимого этапа агрегации.Р е ц е п т о р с и г м а - 1 человека (sigma-1 receptor, S1R) являетсятрансмембранным белком эндоплазматического ретикулума (ЭР), селективносвязывающим широкий спектр соединений, известных, как сигма-лиганды.Доклинические и клинические испытания агонистов S1R показали эффективностьфармакологической активации рецептора в ряде нейродегенеративныхзаболеваний, таких как болезни Хантингтона и Альцгеймера.
Считается, чторецептор сигма-1 является плюрипотентным внутриклеточным модулятором,функционируя как анти-апоптотический белок в условиях клеточного стресса.Тем не менее, детальные механизмы функционирования S1R на молекулярномуровне остаются неизвестными. Отдельную перспективную область исследованийпредставляет изучение взаимодействий S1R с липидами биологических мембран.Несмотря на ранее описанные в литературе последовательности связывания S1R сотдельными типами липидов, белок-липидные взаимодействия S1R и ихфункциональное значение на настоящий момент не изучены детально намолекулярном уровне.Цель и задачи исследования. Ц е л ь ю исследования являлосьустановление структурных характеристик, определяющих межмолекулярныевзаимодействия белков, вовлеченных в процессы развития нейродегенеративныхзаболеваний: атаксина-3, хантингтина и рецептора сигма-1 человека.Соответствующие з а д а ч и исследования:1.
С помощью метода рентгеноструктурного анализа белков установитьатомную кристаллическую структуру С-концевого полиглутамин-содержащегоучастка белка атаксин-3.2. Путем синтеза пептоидной библиотеки соединений разработать исинтезировать вещества, специфически связывающиеся с N-концевой областьюN17хантингтина,атакжеоценитьихантиагрегационныеинейропротекторные свойства.3. С помощью биофизических и биохимических экспериментов исследоватьбелок-липидные взаимодействия сигма-1 рецептора, а также идентифицироватьотвечающие за них структурные особенности белковой молекулы.4.Определитьфункциональнуюзначимостьбелок-липидныхвзаимодействий рецептора сигма-1 в клетках линии HEK293T и первичныхкультурах нейронов.Основные положения, выносимые на защиту.
На защиту выносятсяследующие п о л о ж е н и я :1. Полиглутаминовый тракт белка атаксина-3 находится в двухконформационных состояниях: свободной петли и альфа-спирали. Альфаспиральная конформация стабилизирована двумя протяженными сетямиводородных связей: между атомами пептидной группы i и i + 4 остатков и междукарбокси- и аминогруппами боковых цепей остатков глутамина; при этомводородные связи между боковыми цепями ориентированы параллельно осиальфа-спирали.2. Пептоидное соединение HNP1 специфически связывается с аминоконцевой областью (N17) хантингтина. Пептоидное соединение HNP15предотвращает амилоидогенную агрегацию хантингтина in vitro и являетсянейропротектором в модели болезни Хантингтона.3.
Рекомбинантный рецептор сигма-1 человека кластеризуется наповерхности холестерин-содержащих липосом.4. Сверхэкспрессия рецептора S1R, локализующегося в митохондрийассоциированных мембранах, в клеточной линии HEK293T приводит кувеличению контактной длины между эндоплазматическим ретикулумом имитохондриями. Замены аминокислотных остатков в холестерин-связывающейCARC-последовательности приводят к неправильному позиционированиюрецептора в клетке.
Функционально-активный рецептор необходим дляподдержания синаптических контактов в модельных гиппокампальных культурахнейронов in vitro.Научная новизна работы. Впервые установлена кристаллическаяструктура С-концевой области атаксина-3 с наиболее высоким на данный моментразрешением 2,2 Å.
Показано, что полиГ тракт атаксина-3 может существовать вдвух конформациях: свободной петли и альфа-спирали; при этом, уникальнойструктурной особенностью альфа-конформации полиГ является наличие двухсетей водородных связей (между атомами полипептидного остова и междубоковыми цепями аминокислотных остатков). Синтезирована библиотекапептоидных соединений и идентифицировано пептоитоидное соединение HNP1,специфически связывающееся с N-концевой областью (N17) хантингтина.Продемонстрировано, что вещество HNP1 обладает анти-агрегационными инейропротекторными свойствами in vitro, подавляя агрегацию белка слияния Htt82Q-GFP в клетках линии HEK239T и предотвращая дегенерацию синаптическихконтактов в клеточной модели болезни Хантингтона.
Для рецептора сигма-1человека показано, что он способен связываться с главными липиднымикомпонентами рафтовых микродоменов: холестерином и сфингомиелинами.Рецептор сигма-1 человека был впервые реконструирован в модельные бислойные«гигантские» липосомы. Продемонстрировано, что встраивание рецептора вхолестерин-содержащие бислои приводит к кластеризации рецептора ихолестерина на мембране. Идентифицирован сайт узнавания холестерина всоставе трансмембранного домена. Показано, что наличие стерол-связывающегомотива отвечает за правильное позиционирование S1R в митохондриальноассоциированные области ЭР.
Продемонстрировано увеличение контактнойдлины между ЭР и митохондриями при свехэкспрессии S1R человека в линииHEK293T. Показано, что функционально-активный рецептор сигма-1 необходимдля поддержания синаптических контактов в гиппокампальных культурах in vitro.Научно-практическое значение работы. Представленные данные имеютфундаментальное и практическое значение. Установленная структура полиГтракта высокого разрешения представляет собой новые данные, объясняющиеповедение и фолдинг гомополимерных последовательностей полиГ.
Впервыепоказана эффективность применения пептоидных молекул, связывающихся саминоконцевой областью хантингтина, в качестве веществ-прототиповлекарственных средств на клеточной модели БХ. Соединение HNP1 может быть вдальнейшем использовано для разработки более высокоспецифичныхпроизводных. Рассмотренные белок-липидные взаимодействия S1R1 имеют6важное значение для понимания фундаментальных основ функционированиярецептора в клетке. Разработанная методика встраивания рецептора в бислойныемембраны может использоваться для изучения биофизических основ модуляциибелков-партнеров.
Характеристики
Тип файла PDF
PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.
Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
