Автореферат (1141350), страница 3
Текст из файла (страница 3)
3), провести их анализ и, таким образом, определить уровеньпорогового значения.13Для решения поставленной задачи, вначале были собраны и проанализированыотчетыоработехимико-токсикологическихлабораторий,наркологическихдиспансеров (наркологических больниц), содержащие сведения об обнаруженныхПАВ в пробах обследуемых лиц в разных регионах Российской Федерации.Обработкаданныхотчетовпозволилаоценитьфоновуюобстановкупосинтетическим катинонам – оценка вероятности встречаемости синтетическихкатинонов в пробах лиц, подозреваемых в употреблении вышеупомянутых ПАВ, инаправляемых на освидетельствование органами внутренних дел и медицинскимиорганизациями.
Полученные результаты (всего освидетельствованных лиц нанаркотические средства и психотропные вещества в выбранных регионах иколичество случаев обнаружения синтетических катинонов) использовались прианализе кривых распределения результатов тестирования.Вероятность встречаемости лиц, употребляющих синтетические катиноны,среди лиц, попадающих на предварительный метод исследования (ИХА), составляет:=Подтвержденные_катиноны5 2061==(1)Всего_НС_ПВ223 626 43Вероятность отсутствия синтетических катинонов среди лиц, попадающих наИХА, составляет:1(2)43223 626Эти значения учитывались при оценке величины «cut-off» по анализу1−=223 626 − 5 206=1−распределений результатов, полученных методом ИХА, и построенных с учетомподтверждающего метода анализа (ГХ-МС).Анализ кривых распределение позволяет определить граничное (пороговое)значение концентрации, разделяющее положительные и отрицательные результаты.При этом, при концентрациях выше этого порогового значения, вероятность истинноположительного результата превышает вероятность ложноположительного, а приконцентрациях ниже – истинно отрицательные результаты превалируют надложноотрицательными.
Данное пороговое значение концентрации определяется как«cut-off» при анализе распределений. Сама задача такого анализа относится кматематическому классу задач распознавания. Как следует из теории, пороговое14значение распознавания (в нашем случае определяемое выше значение «cut-off»)должно определяться, исходя из соотношения:1 (|1) = 2 (|2), где (3), гдеp1 и p2 – вероятности появления объектов классов 1 и 2;f(x|1) и f(x|2) – функции распределения для обнаружения объектов классов 1 и 2,нормированные на суммарную единичную вероятность для каждого класса.В нашем случае к классу 1 относятся подтвержденные отрицательныерезультаты методом ГХ-МС, а к классу 2 – подтвержденные положительныерезультаты.Рисунок 3 – Гистограммы распределения числа лиц по диапазонам концентрации,полученные по результатам измерений ИХАТогда с точностью до нормировочного коэффициента амплитуды кривой,распределение, показанное зеленой кривой на рисунке 3, является функцией f(x|1), апоказанное красными кривыми – функцией f(x|2) (с точностью до равенстваплощадей под данными кривыми).
Если бы условия реального тестирования(выборка) соответствовали бы условиям эксперимента ИХА, приводимого в даннойработе, то величины p1 и p2 были бы равны в силу одинакового количества15исследуемых образцов (65 каждый): p1 = p2 = 0.5 (т. е. без учета преваленса).
Но внашем случае они равны: p1 =1 – p, а p2 = p, где величина p рассчитана выше (1) исоставляет 1/43. Тогда для определения истинного «cut-off», соответствующегореальной выборки лиц, попадающих на освидетельствование, функцию f(x|1)(зеленая кривая) следует умножить на величину p1/p2 = (1 – p)/p = 42. Эта функцияпоказана на рисунке 3 кривой черного цвета. Таким образом, величина «cut-off» дляграничной концентрации разделения между классами 1 и 2 попадает в интервал,отмеченный на рисунке 3 черными треугольниками.
Нижняя граница концентрацииравна 101.9 (80 нг/мл), а верхняя составляет 102.05, т.е. 110 нг/мл. Это позволяетиспользовать данный уровень «cut-off» (80–110 нг/мл) в практических целях дляминимизации затрат при проведении ХТИ, в противном случае, многочисленныепробы с ложноположительными результатами анализа на предварительной стадииХТИ будут направлены на трудоемкую подтверждающую стадию аналитическогоисследования, стоимость которой относительна высока.Любое значение из этого диапазона может соответствовать «cut-off»исследуемых реагентов для ИХА при реальной выборке (т.е. c учетом преваленса) иотмеченного выше априорного требования минимизации ошибки на всём интервалеизмерений. Оптимальный уровень порогового значения (100 нг/мл) позволяетминимизировать количество ложноположительных результатов и практическиисключив появление ложноотрицательных результатов. Следует отметить, чтонайденные значения «cut-off» существенно превышают значение данного показателя,найденное по методике ROC-анализа, явно неучитывающей преваленс в реальнойвыборке.
Еще раз отметим, что вероятность p (один на 43) соответствуетобнаружению катинонов среди лиц, попадающих на освидетельствование, а не средивсех людей.Пробоподготовка мочи для ГХ/МСВ виалу на 10 мл вносили 3 мл мочи, добавляли примерно 100 мг смесикарбоната натрия и гидрокарбоната натрия в соотношении 1:2, а также 1–2 г хлориданатрия, перемешивали 10 секунд на вортексе. C помощью шприца для газовойхроматографии добавляли 10 мкл раствора внутреннего стандарта – дифениламин вметаноле с концентрацией 1 мг/мл. К полученному раствору добавляли 2 мл смеси16изопропанол: дихлорметан: гексан (1:7:2).
Встряхивали на вортексе в течение 5минут. Центрифугировали 3 минуты при 1200g (1700 об/мин.). В виалу объемом на 2мл переносили верхний органический слой и упаривали досуха в токе сухого воздухапри нагревании 50○С. Затем сухой остаток перерастворяли в 100 мкл смесиэтилацетат: метанол (1:1) и анализировали методом ГХ-МС.Идентификация синтетических производных катинона и (или) ихметаболитов методом ГХ-МСПри рекомендуемом нами уровне порогового значения 100 нг/мл дляобнаружениясинтетическихкатиноновиихметаболитовнастадиипредварительного метода исследования, следующим шагом было проверитьэкспериментальновозможностькачественнойидентификацииисследуемыхсоединений в моче с концентрацией на уровне рассчитанного «cut-off» висследуемых биобъектах.В литературных данных широко применяется анализ новых ПАВ методом ГХМС в режиме регистрации масс-спектрометра по выбранным ионам (SIM).
Учитываяэтот факт, для идентификации образцов мочи с относительно низкой концентрациейаналитов в режиме регистрации масс-спектров SIM были выбраны ионы: 84 m/z,121 m/z, 126 m/z, 149 m/z для MDPV и 77 m/z, 84 m/z, 105 m/z, 126 m/z, 188 m/z для αPVP (рис. 4). Детектирование производили путем сравнения полученного массспектра пика с библиотечным масс-спектром. При анализе использовали программуавтоматизированной системы масс-спектральной деконволюции и идентификации(AMDIS) и библиотеки масс-спектров NIST 14 и SWGDRUG (версия 3.2, октябрь2017).α-PVPMDPVРисунок 4 – Фрагментация α-PVP и MDPV17Условия хроматографирования: колонка капиллярная GsBP-5MS 30м×0,25 мм,фаза – 0,25 мкм, начальная температура колонки 70°С, выдержка 2 мин, нагрев соскоростью 20°С/мин до 280°С, выдержка 15 мин; газ-носитель – гелий, режимработы инжектора – splitless, скорость потока гелия 1 мл/мин, температураквадрупольного анализатора 150°С; температура ионного источника – 230°С.
Времявключения катодов и анализатора («задержка на растворитель») – через 3,51 минпосле ввода пробы, интервал сканируемых масс 50–550 m/z. Режим работы детектораустановлен по стандартной программе «Autotune».Синтетические катиноны и (или) их метаболиты зачастую присутствуют вмоче в диапазоне концентраций выше рекомендуемого по оптимизированнойметодике уровня порогового обнаружения (как правило свыше 300 нг/мл согласнополученным данным). Таким образом, при проведении ГХ-МС анализа насинтетическиеобнаружениякатиноныаналитовподляметодике,процедурыустановленныйуровеньпробоподготовкиипороговогохромато-масс-спектрометрического анализа достаточен, чтобы надежно идентифицироватьвещества в режиме по полному ионному току (SCAN).
Набор основных метаболитовα-PVP и MDPV (табл. 4) наглядно иллюстрируют хроматограммы образцов мочипотребителейданныхнаркотическихсредств.Пробоподготовкаобразцовосуществлялась по схеме, описанной ранее.Нарисунке5представленахроматограммамочи,вкоторойидентифицированы α-PVP (время удерживания 10.71 мин) и метаболиты – 2-oксо-αPVP (время удерживания 11.82 мин), OH-α-PVP (время удерживания 10.98 мин).Масс-спектры данных соединений приводятся на рисунках 6–8. Хроматограммамочи, содержащей MDPV, в режиме сканирования по выбранным ионам (SIM) имасс-спектр аналита представлены на рисунках 9 и 10.Спектрометрия с выбранным ионом с m/z 126 позволяет контролироватьприсутствие соединений с неизмененным пирролидиновым кольцом, а с ионом с m/z140 – соединений с 2-оксо-структурой.18Таблица 4 – Структурные формулы основных метаболитов α-PVP и MDPVОсновные метаболиты α-PVPОсновные метаболиты MDPV2-оксо-α-PVP2-оксо-MDPVOH-α-PVPOH-MDPVСтруктурная формулаРисунок 5 – Пример хроматограммы мочи, содержащей следующие соединения:1 – α-PVP (10.71 мин); 2 – OH-α-PVP (метаболит α-PVP, 10.98 мин); 3 – 2-оксo-α-PVP(метаболит α-PVP, 11.82 мин)Рисунок 6 – Масс-спектр α-PVP в режиме SCANРисунок 7 – Масс-спектр OH-α-PVP в режиме SCAN19Рисунок 8 – Масс-спектр 2-oксо-α-PVP в режиме SCANРисунок 9 – Хроматограмма мочи в режиме сканирования по выбранным ионам(SIM), содержащей MDPV (12,66 мин)%10084149751211265025090100110120130140150Рисунок 10 – Масс-спектр MDPV в режиме SIMВлияние гидролиза и дериватизации на сохранность исследуемыханалитовПроанализировав полученные результаты проведенного эксперимента поизучению влияния гидролиза для разрушения образующихся во время второй стадииметаболизма ксенобиотиков глюкуронидных конъюгатов, а также дериватизации насохранность и аналитические параметры исследуемых соединений, можно сделатьвывод о том, что OH-α-PVP обнаруживается в моче в свободном состоянии, однако,получениееготрифторацетильногохроматографическиереакционнуюпараметрыгидроксильнуюпроизводногоэтогогруппуметаболита,вструктуре.значительнозакрываяЭтоулучшаетсвободнуюулучшаетегохроматографическую подвижность и позволяет обнаружить его уже в более низкихконцентрациях в объекте.
На сохранность α-PVP и его метаболита 2-оксo-α-PVPпроцедура проведения гидролиза и процесса дериватизации существенно не влияет.20Наличие нативного соединения и 2-оксo-α-PVP, для обнаружения которых нетребуется дериватизация, позволяет надежно идентифицировать факт употребленияα-PVP.Оценка экономической эффективности предложенной схемы проведенияХТИ синтетических производных катинонаДля рациональной работы лаборатории, сокращения сроков выполнениялабораторных исследований, экономической эффективности необходимо провестиоценку затрат на проведение химико-токсикологического анализа конкретноговещества. В этом экономическом разделе показана методика расчета затрат впересчете на один образец мочи, согласно предложенной в работе схемы проведенияХТИ синтетических производных катинона (методами ИХА и ГХ-МС), учитываяоборудование и материальные запасы, используемые в данной методике.При выполнении данной задачи первоначально был проведен расчет затрат наоплату труда основного персонала, затрат на материальные запасы (реактивы ирасходные материалы), суммы амортизации оборудования и эксплуатационныхрасходов на содержание оборудования и инвентаря, после чего был выполнен расчетитоговых затрат.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
