Автореферат (1141129), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Затем на втором этапе были отработаны новыеметодики операции и проведено экспериментальное исследование критическихдефектов на черепах крыс с применением матриксов из ПОБ. В итоге на третьемэтапе проведено экспериментальное исследование критических дефектов начерепах крыс с применением костного каркаса из ПОБ совместно с МСК –тканеинженерной терапевтической системы.На основании полученных ранее данных для изготовления тканеинженернойтерапевтической системы для челюстно-лицевой хирургии был выбран скаффолдиз ПОБ/ГА/АЛГ.ДляпервойстадииизготовлениябиокомпозитногоскаффолдаизПОБ/ГА/АЛГ был использован разработанный ранее модифицированный методвыщелачивания, в котором использовались не один, а два вида порообразователя:карбонат аммония ((NH3)2CO3) и сахароза (C12H22O11).
Все экспериментыпроводили в стерильных условиях в ламинарном шкафу. Для создания пор,оптимальных для культивирования клеток, сахарозу и карбонат аммонияпросеивали через специальные лабораторные сита У1-ЕСЛ (Крафт, Россия) стканью из сетки по ГОСТ 6613-86 и размером ячеек 40, 94 и 315 мкм: размеркристаллов карбоната аммония составил 40-94 мкм, сахарозы – 94-315 мкм.Раствор ПОБ 65 мг/мл в трихлорметане добавляли к смеси карбоната аммония исахарозы (1:3) до состояния смеси, близкому к жидкой пасте.
Для полученияскаффолдов, содержащих гидроксиапатит (ГА), раствор ПОБ 65 мг/мл втрихлорметане диспергировали совместно с ГА в концентрации 6,5 мкг/мл, т.е.соотношение ГА к ПОБ составляло 1:10. Такое соотношение было выбрано наосновании литературных данных и проведенных ранее исследований, какнаименеетоксичноедляМСКиприэтомпридающаяостеокондуктивные и остеоиндуктивные свойства (Рис.1).скаффолдам9Рисунок 1. Метод двойного выщелачиванияЭтой смесью заполняли форму, изготовленную ранее: 3D-форму (рис. 2А).Так как в процессе изготовления КИ применяется органический растворительхлороформ, растворяющий полилактид, формы были изолированы алюминиевойфольгой (рис.2Б).A.Б.Рисунок 2.
Форма для отливки костных матриксов: А. - 3D форма иБ. - Форма для отливки имплантатовПосле испарения растворителя, форму погружали в горячую воду (~ 90°С).На первой стадии метода двойного выщелачивания происходит термическоеразложение карбоната аммония ((NH4)2CO3 → 2NH3 + CO2 + H2O) – при этомобразуются поры меньшего диаметра. При взаимодействии с водой и небольшомнагревании карбонат аммония полностью разлагается с выделением аммиака идиоксида углерода, а сахароза переходит в водную фазу (вымывается).
Процессобразования газов происходит довольно активно, поэтому пористость достигаетсяне только в результате удаления порообразователя, но и за счет деформацииполимера. После прекращения газообразования полученные матриксы удаляли из10формы и промывали дистиллированной водой 5 по 30 мин на шейкере, водуменяли несколько раз до полного вымывания сахарозы. В результате даннойметодики мы получали трехмерные скаффолды с системой сообщающихся пор(табл. № 1).Таблица № 1 – Морфологические характеристики матрикса на основе поли-3оксибутиратаТип скаффолдаС-ПОБС-ПОБ/ГАПористость, %93 ± 192 ± 1Размер пор, мкмМакропорыМикропоры410 ± 7523 ± 8365 ± 6518 ± 7Связность пор++Макропоры больше 300 мкм считаются оптимальным размером дляпроникновения питательных веществ и клеток во всем объеме матрикса.Методики изготовления биокомпозитных скаффолдов описаны в статьях итезисах конференций, опубликованных в рамках настоящего Проекта.Для введения МСК в биокомпозитные скаффолды, т.е.
собственно дляизготовления тканеинженерной конструкции, была использована культура МСКкрыс. МСК были выделены в нашей лаборатории из костного мозга 3-х дневныхкрысят. Для этого бедренные кости крысят были извлечены и очищены от мягкихтканей в стерильных условиях. Эпифизы бедренных костей были отрезаны икостный мозг был извлечен путем промывания культуральной средой в объеме 5мл при помощи шприца с иглой 27G. Извлеченные клетки инкубировали в средеDMEM (Dubecco’s Modified EagleMedium, Invitrogen, США) с коллагеназой I типа(215 Ед/мг белка) 1 час при 37°C.
После чего клетки центрифугировали 10 минпри 1000 об/мин и осадок собирали в пластиковом культуральном флаконе на 25мл. Клетки обеих линий культивировали в среде DMEM, содержащей 10%эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (FCS, Biological Industries, Israel), 100МЕ/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (Invitrogen, США).
Клеткиинкубировали в СО2-инкубаторе MCO-15AC (Sanyo, Япония) при 37ºC ватмосфере, содержащей 5% CO2, среда менялась каждые 3 дня. Клетки снимали с11подложки раствором трипсина (0,05% трипсин (Биолаб, Россия) в фосфатносолевомбуфере (ФСБ)(Serva,Germany)иподсчитывалис помощьюгемоцитометра. Для эксперимента использовали МСК 3-его пассажа.Для введения МСК в матрикс были выбраны матриксы из ПОБ/ГА/АЛГ, вкоторых альгинатный гидрогель был использован в качестве средства введенияМСК в объем полимерного матрикса.
Метод введения МСК в биокомпозитныескаффолды заключался в том, что на стадии заполнения пористых скаффолдов изПОБ/ГА/АЛГ, в скаффолды вводили МСК, предварительно помещенные в 1%альгинат натрия. Порошок альгината натрия (Сигма-Алдрич, Германия),стерилизованный в спирте и под ультрафиолетом, растворяли 6 часов приперемешиваниинамагнитноймешалкевфизиологическомрастворевконцентрации 1,5% в стерильных условиях в ламинарном шкафу.
Затем готовилисуспензию АЛГ с клетками в концентрации 200 000 клеток в 1 мл суспензии(итоговая концентрация альгината составила 1,0%). Полученной суспензией спомощью автоматической пипетки пропитывали полученные на первой стадиискаффолды ПОБ/ГА по 100 мкл (20 000 клеток) суспензии на один скаффолд.После пропитки удаляли лишний альгинат и заливали стерильным 50 мМраствором CaCl2 для полимеризации альгинатного гидрогеля, содержащегоклетки. После инкубации в течение 3 минут в хлориде кальция, матриксыпромывали в фосфатном буфере и затем помещали в среду для дальнейшегоэксперимента (рис.3).A.Б.Рисунок 3. Микрофотографии матриксов: А.
- ПОБ/ГА иБ. - ПОБ/ГА/АЛГ/МСКПолученная тканеинженерная система была использована для исследования12ее терапевтической эффективности на критическом дефекте костной ткани налабораторных крысах in vivo.Для исследования регенерации костей черепа наиболее показательнойявляется модель критического дефекта свода черепа (теменной кости) у крысы,позволяющаяполучитьвоспроизводимыеданныеисравнитьихсмногочисленными результатами других исследований, нами проведено in vivoисследование критических дефектов черепа крысь породы Wistar весом до 400 гр.В эксперимента были использованны 40 крыс, которые были разделены на 4групп по 10 животных в каждой группе.Группа № 1 (контрольная) – у оперированных крыс создан критическийдефект 8 мм и рана ушита наглухо;Группа № 2 – после создание критического дефекта имплантирован матриксПОБ с АЛГ;Группа № 3 – аналогично матрикс ПОБ+ГА+АЛГ;Группа № 4 – матрикс ПОБ+ГА+АЛГ+МСК.Под внутрибрюшинным наркозом «Золетил 100» в дозировке 125 мкг/кгкрысам производили поперечный и вертикальный латерально-смещенный разрезкожи головы, формируя треугольный лоскут и последовательно, тупым и острымпутем обнажали теменные кости.
Посередине сагиттального шва на теменныхкостях формировали круглое отверстие с помощью трепана С-reamer диаметром 8мм из набора Neobiotech SLA (Корея), избегая перфорации сагиттальноговенозного синуса. Костный дефект заполняли изготовленным КИ, которыйотличался наполнением в каждой исследуемой группе. Рану послойно ушивали.(рис.4).13Б.А.Г.Рисунок 4. Этапы операции: A – хирургический доступ Б –сформирован критический костный дефект, В – дефект закрыт костнымматриксом;Г – подшивание костного матрикса к надкостницеВ.Для оценки динамики неоостеогенеза на разных сроках проводилиприжизненноетройноемечениеновообразованнойкостнойтканитетрациклиновыми красителями.
Мечение осуществляли по схеме 7-3-4-3-4-3-4(три дня введения (раствор доксициклина; раствор тетрациклина; ализаринкрасный С) чередовались с четырехдневными перерывами) в дозировке 25 мг/кгмассы тела. Через месяц (28 дней) крыс подвергали эфтаназии, материалотправляли на гистологическое исследование.Результаты рентгенологического исследованияСканирование проводили в конусно-лучевом томографе Point 3D Combi 500C, (Pointnix, Ю.
Корея) на отработанном режиме 63kVp/7mA. Полученырезультаты компьютерной томографии черепов крыс позволили измеритьплощадь регенерации дефектов исследуемых группах, учитывая площадьпервоначального костного дефекта 50,24мм2 (3,14*R(4мм)2). На 5-7 рисункахпредставлен результат измерений критического костного дефекта в контрольнойгруппе и в группах с матриксов на основе ПОБ/АЛГ, ПОБ/ГА/АЛГ. На рисунках8-9представленрезультатизмеренийвгруппе,содержащейМСК,с14минимальным (рис. 8) и максимальным результатом по площади регенерата (рис.9).Рисунок 5.
Рентгенологическая картина критического костногодефекта свода черепа крысы через месяц в контрольной группе. Площадьнеминерализованного костного дефекта составила 45,40 мм2, чтосоответствует 90% от исходной площади дефекта.Рисунок 6. Рентгенологическая картина критического костногодефекта свода черепа крысы через месяц после его заполнения матрикса наоснове ПОБ.
Площадь неминерализованного костного дефекта составила1531,86 мм2, что соответствует 63% от исходной площади дефекта.Рисунок 7. Рентгенологическая картина критического костногодефекта свода черепа крысы через месяц после его заполнения матрикса наоснове ПОБ/ГА. Площадь неминерализованного костного дефектасоставила 20 мм2, что соответствует 40% от исходной площади дефекта.Рисунок 8.
Рентгенологическая картина критического костного дефектасвода черепа крысы через месяц после его заполнения ТИК. Площадь16неминерализованного костного дефекта составила 5 мм2, что соответствует 10%от исходной площади дефекта.Рисунок 9. Рентгенологическая картина критического костного дефектасвода черепа крысы через месяц после его заполнения ТИК. Площадьнеминерализованного костного дефекта составила 0,8 мм2, что соответствует 1,6%от исходной площади дефекта.Результаты гистологического исследованияОсновываясь на данных исследования гистологических срезов образцовкостной ткани при помощи флуоресцентной микроскопии с раздельнымокрашиванием флюорохромами было выявлено, что:1 группа с гибридный матрикс из поли-3-оксибутирата и альгинатаобладает ограничительной функцией, обеспечивая условия для нормальнойрегенерацииплоскихкостейчерепаукрыс.Относительныйобъемвосстановляемой костной ткани в дефекте теменной кости составил в среднем27% (медиана), а соединительная ткань в свою очередь 73 % (медиана)(рис.10А1,10А2).17A1.A2.Рисунок 10.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
