Диссертация (1141039), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Антиоксидантные ферменты и их активаторы:А) Препараты супероксиддисмутазы: эрисод, орготеин (пероксинорм).Б) Препараты ферроксидазы церулоплазмина: церулоплазмин.В) Активаторы антиоксидантных ферментов: натрия селенит (селеназа).Г) Блокаторы образования свободных радикалов: аллопуринол/милурит,оксипуринол, антигипоксанты [3, 9].Механизм действия наиболее распространённых антиоксидантов состоит вобрыве реакционных цепей. Молекулы антиоксиданта взаимодействуют сактивными радикалами с образованием малоактивных радикалов, окислениезамедляется также в присутствии веществ, разрушающих гидроперекиси(диалкилсульфиды и др.).
В этом случае падает скорость образования свободныхрадикалов [58].В настоящее время в качестве антиоксидантной терапии широкоиспользуется антиоксидант эмоксипин. В связи с этимдля коррекции изменениймолекулярно-биохимических показателей плазмы крови и колоноцитов в нашемисследовании мы использовался данный антиоксидант.Эмоксипин (Московскийэндокринный завод) выпускается в ампулах 1%, 1 мл, действующее вещество –метилэтилпиридинолагидрохлорид.Эмоксипинобладаетсвойствамиантиоксиданта и антигипоксанта, а также сосудопротектора и антиагреганта.Антиоксидантные свойства эмоксипина обеспечивают нейтрализацию свободныхрадикалов, прекращение цепных окислительных реакций, а, следовательно,предотвращаютповреждениежизненно-важныхбиологическихмолекул.Свойство антигипоксанта позволяет предотвращать кислородное голоданиевнутренних органов и тканей за счет доставки большего количество газа иусиления его проникновения через сосудистую стенку и мембрану клеток.Сосудопротекторное свойство выражено в способности придавать прочность,гладкость и эластичность стенке сосуда.
Одновременно с увеличением прочностисосудистой стенки снижается ее проницаемость. Гладкая поверхность сосудов39позволяетснизить"склеивание"клеточныхэлементовкрови,атакжепредотвратить их фиксацию на стенках вен и артерий, что позволяет обеспечитьантиагрегантное свойство эмоксипина. Благодаря данному эффекту такжеулучшается текучесть крови, то есть уменьшается ее вязкость. Помимоуменьшения "склеивания" клеток крови, эмоксипин усиливает процессырассасывания тромбов, снижает проницаемость сосудов и предотвращаеткровоизлияния, а также способствует скорейшему рассасыванию последних.
Вцелом антиоксидант эмоксипин увеличивает устойчивость тканей организма кнедостатку кислорода и кровообращения[3, 5, 35, 48].В результате положительного действия антиоксидантов наблюдается:замедление процессов старения и износа клеточных мембран и самих клеток,следовательно, и всего организма в целом, повышение устойчивости квоздействию радиации и других вредных факторов внешней среды, усилениеиммунитета, нормализация функций сердца, сосудистой и нервной систем; крометого, большинство антиоксидантов обладают антиканцерогенным действием [4,33, 70].40ГЛАВА 2МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ2.1 Методика формирования экспериментального лекарственного дисбиозаЭкспериментальныйлекарственныйдисбиозмоделировалипутёмвнутрибрюшинного введения в течение 5 дней раствора гентамицина вконцентрации 80 мкг/мл в пересчёте на массу тела животного [64].Гентамицина сульфат – основной аминогликозид второго поколения,нарушает синтез белка микроорганизмами, оказывает бактерицидное действие вотношении многих грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов,в том числе стафилококков, устойчивых к пенициллину, эшерихий, клебсиелл,энтеробактеров, синегнойной палочки [10].Название группы аминогликозидов связано с содержанием в их молекулеаминосахаров, соединенных гликозидной связью с агликоновым фрагментоммолекулы.
Гентамицин плохо всасывается в желудочно-кишечном тракте, хорошопроникает в ткани и жидкости организма, оказывает повреждающее действие наклеточную и цитоплазматическую мембрану клеток, приводящее к выводу всреду важных низкомолекулярных внутриклеточных продуктов (нуклеотидов,ионов калия), подавляет окисление различных субстратов клетки, нарушаетсинтез белка на уровне 30S-субъединиц рибосом, путем нарушения процессатранскрипции и-РНК в рибосомах бактерий, что приводит к их гибели.Гентамицин обладает устойчивостью к действию микробных ферментов ирезистентность у микробов формируется медленно, что определяет егопреимущество перед другими аминогликозидами [64].2.2 Количественное и качественное исследование мукозной микрофлорытолстого кишечникаКоличественное и качественное исследование мукозной микрофлорытолстого кишечника мышей проводилось по методике Кафарской Л.И.
иКоршунова В.М. [17, 106]. Биоптаты слизистой оболочки толстого кишечника41освобождались от химуса и взвешивались в стерильных условиях. После этогоматериал помещался в стерильный раствор фосфатного буфера рН 7,0 всоотношении 1:10 и выдерживался в нём 2 часа для разжижения муцина. Затем изисследуемого материала готовились мазки, которые окрашивались по Граму, ипроизводилось разведение исследуемого материала до концентраций 10 -2-10-4. По0,1 мл каждого разведения взвеси засевали газоном на поверхность питательныхсред (Эндо, Сабуро, SSA-агар, ЦПХ-агар, кровяной агар, желточно-солевой агар,висмут-сульфит агар, лактоагар, бифидоагар) и инкубировали при температуре370С в аэробных и анаэробных условиях. Идентификацию микроорганизмовпроводили с помощью микробиологического анализатора «Multiskan-Ascent» икоммерческих тест систем: ЭНТЕРОтест-16, СТАФИтест-16, Стрептотест-16, ЭнКОККУСтест-16 («Лахема» (Чехия)); API 50 CHL – для идентификациилактобацилл и бифидобактерий («Биомерье»).
Количество бактерий в 1 граммематериала рассчитывали исходя из числа выросших колоний микроорганизмов –колониеобразующих единиц (КОЕ) при посеве из максимального разведения, гдеотмечался рост не менее 10 колоний, учитывая при этом объём посевногоматериала.Длярасчётаиспользовалиформулу:К=Е/к*v*n,гдеК–колониеобразующая единица, Е – общее количество бактерий, к – количествовнесённого материала, v– количество чашек Петри, n– разведение. Удельноесодержание микроорганизмов вычисляли как количество микроорганизмов,выделенных из биопроб, и выражали как lg КОЕ/г массы биологическогоматериала [55, 93, 106, 144].2.3 Определение продуктов ПОЛ и ферментов АОЗмакроорганизмаПодготовка материала для исследованияПлазма крови.
Забор крови животных производили в чистую пробирку,предварительно добавляя 1-2 капли гепарина, распределяя его по стенкам, последобавляли 2 мл крови. Центрифугировали при 1500 оборотах 20 минут. Плазмузабирали и помещали в эппендорф, V=1,5 мл.
Хранили в холодильнике притемпературе -25°С.42Ткань толстого кишечника. 120 мг ткани толстого кишечника взвешивалина аналитических весах, помещали в гомогенизатор, измельчали до однородноймассы, добавляли 1 мл 0,025 М трис-НСl буфера (pH 7,4). Получившуюся смесьпомещали в эппендорф, V=1,5 мл. Хранили в холодильнике при температуре 25°С.Определение промежуточных и конечных продуктов ПОЛАцилгидроперекиси.Промежуточныйпродуктперекисногоокислениялипидов. Определение производили используя смесь гептана и изопропана сдобавлением соляной кислоты.
Образовавшийся гептановый слой измерялиспектрофотометрически при длине волны 233 нм против контрольной пробы.Измерение проводилось в условных единицах. К 0,2 мл гомогената тканитолстого кишечника или плазмы крови добавляли 6 мл смеси гептана иизопропанола, а затем 1 мл соляной кислоты и интенсивно встряхивали. Послерасслоения фаз отбирали гептановый слой, в котором спектрофотометрическимметодомс использованием спектрофотометра «Apel 330 PD» (Япония), измерялисодержание ацилгидроперекисей при длине волны 233 нм против контрольнойпробы и выражали в условных единицах [90, 92].Малоновый диальдегид.Конечный продукт перекисного окисления липидов.Для определения малонового диальдегида к 0,02 мл исследуемой пробыдобавляли 0,5 мл смеси тиобарбитуровой и уксусной кислоты в соотношении 1:1,а затем инкубировали 60 минут при температуре 100оС.Измеряли оптическуюплотность при 532 нм с использованием спектрофотометра «Apel 330 PD»(Япония) и рассчитывали количество малонового диальдегида с помощьюнаборов «ТБК-Агат».
Результаты выражали в мкмоль/г белка ткани в гомогенатеткани кишечника и мкмоль/л в плазме крови[37, 90, 92].Определение ферментов антиоксидантной системы макроорганизмаСупероксиддисмутаза.спектрофотометрическимАктивностьметодом,супероксиддисмутазыоснованнымнаопределялиопределениистепениторможения реакции восстановления нитросинего тетразолия. Для этого 0,02 млэкстракта гомогената ткани толстого кишечника или плазмы крови вводили в 3 мл43инкубационной среды, содержащей 0,41 мМ нитросинего тетразолия, 0,33 мМЭДТА,0,01мМN-метилфеназонияметилсульфата.Измерялиоптическуюплотность на спектрофотометре«Apel 330 PD» (Япония) при длине волны 540 нм,затем добавляли в кювету 0,1 мл 0,8 мМ НАД-Н, перемешивали и оставляли втемноте на 10 мин, после чего повторно измеряли оптическую плотность.
Ореакциисудилипоразницемеждупервымивторымпоказаниямиспектрофотометра. За условную единицу активности супероксиддисмутазыпринимали 50% торможение реакции восстановления нитросинего тетразолия [90,92].Каталаза. Активность каталазы определяли методом, основанным наспособности перекиси водорода образовывать с солями молибдена стойкийокрашенный комплекс, для чего к 0,1 мл гомогената ткани толстого кишечникаили плазмы крови добавляли 2,0 мл 0,03% раствора перекиси водорода. После 10минутной инкубации при 37оС останавливали реакцию добавлением 1,0 мл 4%раствора молибдата аммония. Интенсивность окраски измеряли фотометрическимметодом при длине волны 410 нм с использованием спектрофотометра «Apel 330PD» (Япония). Активность каталазы рассчитывали по формулеА (мкат/л) =, выражали в мкат/г ткани в гомогенате ткани толстого кишечникаили мкат/мл в плазме крови [92].2.4 Количественное и качественное определение липидных фракций мембранэритроцитовЭкстракция липидов мембран эритроцитовЭкстракцию липидов проводили из чистой эритроцитарной массы вколичестве 0,5 мл при помощи последовательного добавления 0,5 млдистиллированной воды, 5,5 мл изопропанола и 3,5 мл хлороформа спромежутком времени в один час, интенсивно перемешивали на вибромешалке.После чего, полученный экстракт фильтровали через бумажный фильтр [78].44Нанесение образцаПолученный фильтрат липидов мембран эритроцитов использовали дляфракционированияфосфолипидов:лизофосфатидилхолина(ЛФХ),сфингомиелина (СМ), фосфатидилинозитол/серина (ФИ/ФС), фосфатидилхолина(ФХ), кардиолипина (КЛ), фосфатидилэтаноламина (ФЭ) и нейтральных липидов:холестерола (ХС), моноацилглицеролов (МГ), диациоглицеролов (ДГ), свободныхжирных кислот (СЖК), триацилглицеролов (ТГ), эфиров холестерола (ЭХС).Перед нанесением, липидный экстракт упаривали на водяной бане притемпературе 70°С.
Сухой остаток растворяли в 0,5 мл хлороформ-метанольнойсмеси (3:1) и отбирали в пластиковую пробирку с крышкой объемом 1,5 мл. Сцелью очистки от загрязнителей и иннактивации пластин во время нанесенияобразца их помещали в камеру со смесью хлороформ-метанол (1:1) до подъемарастворителя до верхнего края, после чего высушивали пластины при комнатнойтемпературе. Экстракт наносили при помощи микрошприца «Galmelton» в видеузкой полоски длиною в 1 см, по 8 образцов на одну пластину «Sorbfil» (Россия) вколичестве 20 мкл.
Предварительно, пластины размечали, определив линиюстарта (1,5 см от основания пластины) и линию финиша (1 см от верхнего краяпластины) [105].Метод тонкослойной хроматографииХроматографирование проводили по методу Крылова В.И. [66, 76] внасыщенных парами растворителей четырехгранных камерах размером 180 мм ×6 мм × 160 мм, в которых пластины устанавливали вертикально. Дляхроматографированияфосфолипидовиспользовалисистемуэлюэнтов:хлороформ:метанол:аммиак в соотношении 65:35:5, а для нейтральных липидов –гептан:петролельный эфир:ледяная уксусная кислота в соотношении 60:40:4.Фракционированиелипидовпроводилиприкомнатнойтемпературе:фосфолипидов дважды, а нейтральных липидов однократно до поднятиярастворителя до линии финиша.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
