Диссертация (1140928), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Раковые СЭМС построены израковых клеток и характеризуются высокой экспрессией маркера пролиферацииKi67, онкомаркеров р16, C-MYC, р53, маркеров стволовости ALDH1, CD34, Vim,и маркера гипоксии HIF-1.В неопластических и раковых СЭМС определяются атипичные клетки,экспресирующие одновременно онкомаркеры и маркеры стволовости.С целью создания групп было проведено клинико-морфологическоеисследование материала от 4672 женщин в возрасте от 17 до 56 лет (средний115возраст 36,5±4.5 лет), проходивших обследование и лечение в ФГБУ «Научныйцентр акушерства, гинекологии и перинатологии им.
академика В.И.Кулакова»Минздрава РФ в 2013, 2014 и 2015 годах. Обследование всех 4672 женщинпроводили по общепринятому протоколу - клинический осмотр, взятие мазков вSurePath виалы (BD, США), приготовление цитологических препаратов,окрашенных по Папаниколау, с помощью TriPath процессора (BD, США), оценкамазков по системе ―Bethesda‖ [114]. В результаты были отобраны 3 группыженщин:1) 91 женщина для оценки эффективности ВПЧ-тестирования методом ПЦР-НВи жидкостной цитологии при выявлении ВПЧ-ассоциированной цервикальнойпатологии у женщин до 30 лет и старше.2) 148 женщин для оценки эффективности комплекса методов: жидкостнойцитологии, двойного иммуноокрашивания p16/Ki67 и ВПЧ-тестированияметодом ПЦР-НВ при ВПЧ-ассоциированной цервикальной патологии.3) 61 женщина для изучения морфологических и иммуногистологическихособенностей СЭМС разных видов.Ткань фиксировали в 10% нейтральном формалине, готовили серийныепарафиновые срезы, которые окрашивали гематоксилином и эозином ииспользовали для иммуногистохимических реакций по общепринятым методикам(Петров С.В., Райхлин Н.Т., 2004), В качестве первичных антител применялисьмоноклональные антитела к онкомаркерам -- P53 (RTU, клон DO-7 RTU,N158187-2, DAKO), C-Myc (clone Y69, Abcam), антитела для двойной окраски116p16/Ki67 (CINtec PLUS cytology kit, Рош); антитела к маркерам гипоксии иангиогенеза -- HIF1-alpha (клон 241812, R&D Systems), VEGF (clone EP1176Y,ab52917, Abcam), к маркерам стволовости - Oct-4 (MRQ-10, 309M-15,CELLMARQUE CORPORATION), Aldh1A1 (clone EP1933Y, cat.
GTX61645, GeneTex),CD34 (Class II, clone QBEnd 10, DAKO), Vimentin (clone V9 RTU, DAKO), а такжеNF-kB (cloneE379, Abcam). Ядра докрашивали гематоксилином. Ставилисьположительные и отрицательные контрольные реакции. Результаты оценивали поколичеству окрашенных эпителиальных клеток СЭМС и прилежащего плоскогоэпителия в процентном соотношении из расчета на 300 клеток. Статистическаяобработка накопленных данных, их группировка, построение графиков идиаграмм проводилась при помощи пакета статистических программ IBM SPSSStatistics 23.0 и Microsoft Excel 2010. Морфометрическое исследование проведенос помощью программы CellSens Standard. Для оценки эффективности методовиспользовался ROC-анализ.
Для поиска связей между показателями использоваликоэффициент корреляции Пирсона и коэффициент ранговой корреляции Спирмена,для сравнения показателей в группах использовали непараметрический критерийМанн-Уитни. Различия считали статистически достоверными (статистическизначимыми) при р.<0,05.На первом этапе оценивалась диагностическая значимость ВПЧ-тестированияметодомПЦР-НВ,жидкостнойцитологииприВПЧ-ассоциированнойцервикальной патологии у женщин до 30 лет и старше.
Обследовалицитологический, биопсийный и операционный материал от 91 пациентки, из117которых 35 женщин были в возрасте до 30 лет и 56 пациенток старше 30 лет.Использовались методы ПЦР-НВ, жидкостной цитологии, гистологии и ИГХр16(INK4A)/Ki67. Эффективность выявления ЦИН2+ у пациенток до 30 лет истарше30летсиспользованиемчувствительность - 81,8% и 90,5% ,ДНКВПЧ-тестированиясоставила:специфичность - 30,4% и 47,2 %; сиспользованием жидкостной цитологии: чувствительность - 65,5% и 71,4%,специфичность - 100,0% и 97,2 %.На втором этапе оценивалась эффективность двойного окрашивания p16/Ki67в сочетании с жидкостной цитологией и ВПЧ тестированием при выявлениицервикальнойинтраэпителиальнойнеоплазиишейкиматки.Обследовалицитологический и биопсийный материал 148 женщин с патологией шейки маткиметодами жидкостной цитологии, ИЦХ с двойной окраской р16/Ki67 иВПЧ-тестирования.
Максимальная эффективность цитологического метода былавыявлена при диагностировании ЦИН ≥ II (чувствительность 95,31% испецифичность 100%), ВПЧ-тестирования - ЦИН <II (97,14%, 50,0%), ЦИН ≥ II(98,48%, 100,0%), ИЦХ – при диагностировании хронического цервицита (92,68%,100,00%), ЦИН<II (94,73%, 100,00%), ЦИН ≥ II (98,48%, 100,00%).На третьем этапе изучались морфологические и иммунофенотипическиеособенности СЭМС при ВПЧ-ассоциированном плоскоклеточном предраке и ракешейки матки.
Проводилось гистологическое исследование материала от 61пациентки с цитологической и ПЦР диагностикой ВПЧ-ассоциированнойпатологии шейки матки: хроническом цервицитом (15 женщин), ЦИН<II (12118женщин),ЦИН≥II(25женщин)имикро-инвазивнойплоскоклеточнойкарциномой шейки матки (9 женщин).В ходе гистологического и ИГХ исследований были выявлены разные видыСЭМС. СЭМС были идентифицированы при ИГХ реакции по экспрессии Oct-4,экспрессия этого маркера наблюдалась во всех клетках сфероидов.По структурными особенностями и экспрессии биомаркѐров СЭМС былиразделены на три вида: репартивные, неопластические, раковые.Репаративные СЭМС формировались вблизи и на территории акантотическихтяжей вокруг сосудов, имели небольшие размеры и состояли из крупныхэпителиальных клеток типа базальных.
Обнаруживались СЭМС 1 вида, прихроническом цервиците и ЦИН<II. При морфометрическом исследованиирепаративные СЭМС имели наименьший размер, их средняя площадь составила1141.1±305.0 mkm2. При двойной окраске p16/ Ki67, эпителиальные клеткирепаративных СЭМС экспрессировали только Ki67 в 20% клеток и не содержалир16. В эпителиальных клетках репаративных СЭМС не выявлялась экспрессияр53 и CD34, но экспрессия CD34 были выявлены в цитоплазме эндотелиальныхклеток капилляров в центре СЭМС, а также в эндотелии сосудов подслизистогослоя.ОбнаруживаласьэкспрессияHIF-1в25%эпителиальныхклетокрепаративных СЭМС, VEGF - в 35%, C-MYC - в 30%, Vim - в 40% и ALDH1 - в0.25%.Неопластические СЭМС имели более крупные размеры, в центре не всегдаопределялись сосуды, в составе СЭМС имелись эпителиальные клетки с119признаками атипизма.
Они обнаруживались при ЦИН<II, ЦИН≥II, а также примикроинвазивной карциноме в окружающей ткани. При морфометрическомисследовании неопластические СЭМС имели большие размеры по сравнению срепаративными (Р.<0/001), их средняя площадь составила 2553.9±656.2 mkm2.При двойной окраске p16/ Ki67 в эпителиальных клетках неопластических СЭМСнаблюдалась экспрессия одновременно двух маркеров в 40% клеток. ЭкспрессияC-MYC определялась в 45% эпителиальных клеток СЭМС, р53 - в 10%, HIF-1 - в60% и VEGF - в 50%, ALDH1 - в 30%, и Vim - в 70%.
В эпителиальных клеткахнеопластических СЭМС экспрессия CD34 не определялась.Раковые СЭМС имели крупные размеры, часто сливались между собой и былиобразованыатипичнымираковымиклетками.Приморфометрическомисследовании раковые СЭМС обладали наибольшими размерами по сравнению срепаративными и неопластическими СЭМС - 7308.7±3031.3 mkm2 (Р<0/001) инередко сливались друг с другом. Раковые СЭМС обнаруживались примикроинвазивной карциноме. При двойной окраске p16/ Ki67 в клетках СЭМС 3вида одновременная экспрессия p16/ Ki67 выявлялась в 72.5% атипичныхэпителиальных клеток, C-MYC - в 55%, р53 - в 70%, HIF-1 - в 70% и VEGF - в92,5%. В наблюдаемых нами случаях, обнаруживалась диффузная экспрессияALDH1 в 40% клетках раковых СЭМС и Vim - в 75%.
При микроинвазивнойкарциноме, экспрессияCD34была выявленане тольков цитоплазмеэндотелиальных клеток, а в 50% эпителиальных клеток раковых СЭМС.120ВЫВОДЫ1. Проблему диагностики и скрининга предрака и рака шейки матки можноэффективно решить за счет использования комплекса методов – жидкостнойцитологии, ВПЧ тестирования и ИЦХ с двойной окраской р16/Ki67,чувствительность и специфичность которых возрастает до 98,48% и 100%соответственно.2.
Ранняя диагностика патологии шейки матки, ассоциированной сВПЧ,должна базироваться на возрасте женщин. У женщин моложе 30 летобследование должно начинаться с жидкостной цитологии, старше 30 лет – сВПЧ-тестирования.3. КанцерогенезиморфогенезВПЧ-ассоциированнойплоскоклеточнойкарциномы шейки матки связан с последовательным развитием структурныхизменений, характеризующихся образованием Оct4-позитивных репаративных,неопластических и раковых СЭМС.4. Репаративные СЭМС встречаются при хроническом цервиците и ЦИН<II,средняя площадь их составляет 1141.1±305.0mkm2, они формируются вблизи ина территории акантотических тяжей вокруг сосудов. Характеризуютсяотсутствием клеточного атипизма, отсутствием экспрессии р16, р53, CD34, атакже низкой экспрессией маркера пролиферации Ki67, маркера стволовостиALDH1, и умеренной экспрессией C-MYC,Vim и маркера гипоксии HIF-1.5.
Неопластические СЭМС, средняя площадь которых составляет 2553.9±656.2mkm2, встречаются при ЦИН<II и ЦИН≥II и формируются вне зависимости от121расположения сосудов, их клетки характеризуются признаками клеточногоатипизма, отсутствием экспрессии CD34, низкой экспрессией онкомаркера р53,умеренной экспрессией маркера пролиферации Ki67, онкомаркеров р16,маркера стволовости ALDH1 и высокой экспрессией C-MYC, Vim, маркерагипоксии HIF-1.6. Раковые СЭМС обнаруживаются при микроинвазивной карциноме, их средняяплощадь составляет 7308.7±3031.3 mkm2. Раковые СЭМС формируются внезависимости от расположения сосудов, построены из раковых клеток, нередкосливаются в крупные конгломераты, характеризуются высокой экспрессиеймаркера пролиферации Ki67, онкомаркеров р16, C-MYC, P53, маркеровстволовости ALDH1, CD34, Vim, и маркера гипоксии HIF-1.7.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
