Диссертация (1140225), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Методы диагностики MGUS .Основной диагностический маркер моноклональных гаммапатий –интактныйплазматическиемоноклональныйклеткииммуноглобулин.секретируютмолекулыЗлокачественныемоноклональныхиммуноглобулинов – mIg, и в большинстве случаев это происходитпараллельно с продукцией свободных легких цепей – FLC. Каждая молекулаиммуноглобулина состоит из двух тяжелых цепей, определяющих ее класс(G, A, M, D, E) и двух легких цепей κ - и λ, при этом продукция κ легкихцепей в два раза превышает продукцию λ-цепей.
Легкие цепи λ-типапредставляют собой димеры с молекулярной массой 50 кДа, в то время как κсвободные легкие цепи являются мономерами с молекулярной массой 25кДа, что позволяет им проходить через гломерулярный фильтр почек созначительно большей скоростью. Именно разница в молекулярной массе иструктуре обусловливает разную скорость фильтрации κ - и λ – свободныхлегких цепей через почечные клубочки и объясняет наблюдаемое в нормеотношение: κ/λ в сыворотке крови, равное 0,625. Часть продуцируемыхлегких цепей не связывается с тяжелыми цепями и образует фракцию21свободных легких цепей – FLC, которая высвобождается в русло крови.
Внорме концентрация свободных легких цепей в сыворотке крови низкая.Циркулирующие в сыворотке крови свободные легкие цепи могутформировать гомодимеры, известные как белок Бенс-Джонса, которыйявляетсямаркероммножественноймиеломыБенс-Джонса.Скоростьклубочковой фильтрации данных высокополимеризованных форм меньше,чем молекул κ - и λ – свободных легких цепей.До недавнего времени диагностика, мониторинг и оценка прогнозамоноклональных гаммапатий основывалась на количественном определениициркулирующих моноклональных интактных иммуноглобулинов.
К нимотносятся: электрофорез белков сыворотки крови с количественнымопределением уровня М-градиента, иммунофиксация белков сывороткикрови с определением их типа, электрофорез белков суточной мочи сколичественнымопределениемиммунофиксациябелковуровнясуточноймоноклональногомочи.Длябелкаиидентификациииколичественной оценки моноклональных белков в лабораторной диагностикеприменяет в первую очередь электрофорез белковых фракций.
Признаком,косвенноуказывающимнавозможноеналичиемоноклональногокомпонента, является – пик электрофореграммы, который можно измерить спомощью денситометрии.Электрофорез (ЭФ) принадлежит к базовым методам клиническойбиохимии и широко используется при исследовании нарушений белковогоспектра сыворотки крови, мочи.Основнойпринципэлектрофоретическогометодаисследованиязаключается в том, что находящиеся в растворе молекулы, располагающиеэлектрическим зарядом, под действием сил электрического поля смещаютсяв сторону противоположно заряженного электрода. Скорость миграциивещества в среде с одной и той же силой электрического поля зависит отразмера частиц и величины электрического заряда.
Под влиянием силэлектрическогополякомпонентыразгоняемойбелковойсистемы22распределяются согласно их заряду, приобретая соответствующую скоростьдвижения, то есть происходит электрофоретическое разделение белков нафракции.Внедрение электрофоретических носителей привело к улучшениютехнологий и одновременно к упрощению фракционирования белков. Вкачестве носителей используются фильтровальная бумага, ацетатцеллюлоза,различные гели (полиакриламид), агароза и другие. При этом во времяэлекрофореза, наряду с разделением белковых частиц согласно их зарядам,вступает в силу так называемый молекулярно-ситовой эффект, когда гелеваяструктура ведет себя по отношению к ионам как фильтр.
Ионы,превышающие пористость фильтра, не проходят или проходят оченьмедленно, а более мелкие ионы быстрее проникают через поры носителя.Таким образом, скорость передвижения зависит не только от заряда иона, нои от величины пор геля, формы пор, величины движущихся ионов,взаимодействия между матрицей геля и движущимися ионами (адсорбция идругие).Согласно одному из подробных источников, посвященных этимвопросам история создания метода электрофореза белков началась с 1807года, когда профессор Московского государственного университета ФёдорФёдорович Рейсс открыл такие явления, как электрический эндосмос икатофорез.
Однако практическое использование этого процесса в биологии имедицине началось значительно позже и связано с именем лауреатаНобелевской премии по химии Arne Wilhelm Kaurin Tiselius, который в 1938году под руководством своего учителя Theodor’а Svedberg’а который понял,что раствор белков - это коллоидный раствор, сумел довести техникуэлектрофореза и оптические методы контроля за миграцией молекул белковдо такого совершенства, что смог разделить белки, которые его учитель немог разделить при помощи центрифуги, разработав метод электрофореза всвободной жидкости и сконструировав гораздо более чувствительный прибордля электрофореза смесей белков методом свободных или подвижных23границ.
Основным недостатком этого метода являлось выделение тепла припрохождении через жидкость электрического тока, что препятствовалочеткому разделению фракций и приводило к размыванию границ междуотдельными зонами. В 1940 году Philpot J.S.I. предложил использоватьколонки с градиентом плотности буферных растворов, что препятствовалоконвекции, стабилизируя зоны, которые образовывались в процессеэлектрофореза, а в 50-е годы H. Svensson’ом метод был усовершенствован ина его основе создан прибор для электрофореза в градиенте плотности.Однако метод оставался недостаточно совершенным, так как послеотключения электрического тока, образовавшиеся в ходе электрофорезазоны, расплывались. Последующие достижения в электрофорезе связаны состабилизацией зон в твердой поддерживающей среде.
В 1950 году в качестветвердого носителя стали использовать фильтровальную бумагу, в 1955 годуO. Smithies’ом было предложено использовать крахмальный гель, а уже в1957 году J. Kohn предложил использовать в качестве твердого носителяпленки ацетатцеллюлозы, которые до настоящего времени остаются однимииз наиболее часто используемых носителей при клинических исследованиях.Примерно в это же время был разработан метод, в котором в качествеосновы использовалась агароза. В 1960 году был разработан более точныйметод капиллярного электрофореза и в 1989 году был внедрен в практикусоответствующий анализатор, на основе капиллярного электрофореза.Для обнаружения аномалий белкового профиля на сегодняшний деньизвестныразличныесовременныеиммуноферментные,иммуно-хемилюминесцентные, нефелометрические и иммунотурбидиметрическиеметоды, но при всей информативности и доказательности они пока восновноммалодоступныиз-занеобходимостииспользованиядорогостоящего оборудования.Поэтому электрофоретический анализ белков сыворотки и сегодняостается наряду с биохимическим анализом крови наиболее применимымскрининговымметодомисследования.Известенрядсвоеобразных24электрофоретических синдромов - типичных картин электрофореграмм, втом числе образуемых моноклональными белками в виде характерногопатологическогопикана денситометрической кривой, как правило вобласти γ-гаммаглобулинов – М-градиента (от слова моноклональный).Метод электрофореза является «золотым стандартом» для выявлениямоноклональныхгаммапатий,скоторогоначинают диагностическийскрининг этого состояния, после выполнения общеклинических методовисследования (общий анализ крови и мочи), развернутого биохимическогоанализакрови(белковыефракции,уровенькреатинина,мочевины,электролитов и другие показатели).Основное значение придают оценке величины М-градиента, котораяотражает массу опухоли.
В связи с этим М-градиент (М-пик) являетсянадежным и достаточно чувствительным маркером секретирующих Вклеточных неоплазм при массовых обследованиях. Больным, у которыхвысока вероятность МГ, но обычный электрофорез не выявил М-пика, атакже с целью уточнения типа МГ показан электрофорез с иммунофиксацией(ИФ). Однако легкие цепи (каппа или лямбда) в сыворотке крови выявляютсяметодом иммунофиксациии только при условии, что их концентрацияпревышает 10 норм.Кроме того метод ИФ не является количественным и поэтому не даетвозможности измерить концентрацию моноклонального компонента. В то жевремя его применение позволяет получить результат в течение часа, важнымдостоинством метода является его высокая чувствительность. Кроме того,даже при избытке антигена получается видимая картина.Для выявления моноклональных компонентов методом ИФ в сывороткекрови используются специальные наборы реагентов.
Вначале белкиразделяютсявэлектрическомполевгелеагарозыприрН8,8.Дополнительные полосы, которые обнаруживаются в первую очередь в зонахγ- и β-глобулинов, указывают на наличие гаммапатии. Для идентификацииэтих полос используют иммунофиксацию с помощью моноспецифических25антител против γ-(IgG), α-(IgA), μ-(IgM) тяжелых цепей, а также κ- и λсвободных легких цепей, что позволяет идентифицировать моноклональныеполосы,обнаруженныеиммунопреципитатовприбелкиэлектрофорезе.окрашиваютПослекислымобразованияфиолетовымилиамидошварцем.При проведении электрофореза с ИФ образец сыворотки или мочинаносится шесть раз. Один из них необходим для получения обычнойэлектрофореграммы, на каждый из остальных образцов после окончанияпроцедуры электрофореза наносят антисыворотки против тяжелых илисвободныхлегкихцепей.Моноклональнаягаммапатияпроявляетсяобразованием резко окрашенной полосы в виде дуги в месте взаимодействиясо специфической антисывороткой против присутствующего фрагментаиммуноглобулина [29].При плазмаклеточных дискразиях может секретироваться значительноеизбыточное количество κ или λ легких цепей, которые присутствуют вциркуляции, не будучи связанными с тяжелыми цепями Ig.
Эти свободныелегкие цепи были называны белком Бенс Джонса по имени английскогохимика и врача, еще в 1845 г. предположившего белковую природупатологической термолабильной субстанции в моче пациента, страдавшего“mollities ossium”. Названия κ и λ изотипы легкие цепи получили в честьисследователей L.
Korngold и R. Lipari, впервые выделивших два классабелка Бенс Джонса при множественной миеломе [5].Вначале2000-хгодовпоявилсяновыйавтоматизированныйчувствительный количественный турбидиметрический метод определениясодержания свободных лёгких цепей в сыворотке крови – «Freelite».Принцип действия метода основан на взаимодействии легких цепей (LC)типа κ и с высокоспецифичными для них антисыворотками (овечьи анти-ки анти-λ антитела против эпитопов лёгких цепей). При этом достигаетсявзаимодействие антител с теми частями (эпитопами) LC, которые обычнозакрыты для прикрепления, так как взаимодейсвуют этой поверхностью с26тяжелыми цепями при построении полного Ig.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
