Автореферат (1139724), страница 4
Текст из файла (страница 4)
кавказская, O. sericea Willd. – о. шелковистая),сем. Juglandaceae – ореховые (Juglans cinerea L. – орех серый, J. regia L. –о. грецкий, J. nigra L. – о. чёрный), Urticaceae – крапивные (Urtica dioica L. –крапива двудомная) как самостоятельно заготовленные в различные фазы вегетации в регионах Северного Кавказа (Ставропольский край, КарачаевоЧеркесская Республика (КЧР), Краснодарский край, Республика Дагестан), Московской области в 2009-2015 гг., так и промышленного производства. Такжеобъектами исследования являлись фармацевтические субстанции, ЛФ и ЛРП,полученные из исследуемого ЛРС, а также полученные стандартные образцынафтохинонов.Сравнительный прогноз биологической активности 14 основных нафтохинонов составлен с использованием отечественного онлайн-сервиса PASSOnline (http://www.pharmaexpert.ru/PASSOnline/index.php).17Внешние диагностические признаки ЛРС определены визуально, микроскопические – используя микроскоп «МИКРОМЕД-1» с тринокулярной насадкой и цифровой камерой Electronic Eyepiece MD300 в соответствии с требованиями ГФ XI и ГФ XIII.Для идентификации, разделения и количественного определения нафтохинонов и других групп БАВ в ЛРС, фармацевтических субстанциях и ЛФ, анализа полученных СО использовали тонкослойную, колоночную, высокоэффективную жидкостную хроматографию, хромато-денситометрию, УФ-, ИК-, хромато-масс- и ЯМР-спектроскопию, фотоэлектроколориметрию.Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью программы Microsoft Excel с использованием критерия Стьюдента(Р = 95%).Разработку методологических подходов к изучению лекарственных растений, содержащих нафтохиноны, и созданию на их основе ЛРП проводили всоответствии с самостоятельно разработанным дизайном исследования.Выявление зависимости фармакологической активности нафтохинонов отструктуры соединенияУстановленная in silico методом компьютерного моделирования для 14нафтохинонов зависимость в ряду: «химическая структура соединения – биологическая активность» позволила выявить перспективные направления фармакологических исследований: протекторное в отношении целостности мембран ислизистой оболочки, фунгицидное, антимикробное, гемостатическое, антипротозойное и антисеборейное действие.
Наибольшей широтой терапевтическогодействия обладают молекулы, лишённые боковых углеродных цепей – юглон илавсон. С увеличением боковой углеродной цепи и образованием сложноэфирной связи (например, в структуре производных шиконина) происходит заметное уменьшение числа видов фармакологической активности, за счёт чего реализуется селективное воздействие на тот или иной патологический процесс.Эти данные позволяют проводить целенаправленный поиск новых ЛС, содержащих нафтохиноны, а также вносят вклад в установление механизмов их действия.
При введении БАВ этой группы в токсических дозах возможны дрожь,гепатотоксичность, подергивания, афтозные язвы, а также некоторые другиепобочные эффекты.18Систематизация сведений о биосинтезе природных производных1,4-нафтохинонов, в котором задействованы несколько сопряженных метаболических путей, составление максимально подробных схем вносит вклад в теоретическую базу информации об этой группе БАВ.Потенциально высокая фармакологическая активность и наличие доступной отечественной сырьевой базы позволили отдать предпочтение изучениюшиконина, юглона, филлохинона и ЛРС, их содержащих.Способы получения стандартных образцов нафтохинонов, разработка ивалидация методик анализа этой группы БАВ в ЛРСРанее нами проводился фитохимический скрининг 8 видов из 7 родовсем.
Boraginaceae флоры Северного Кавказа, в результате которого установлено, что перспективным источником шиконина (5,8-диокси-2-(4-метил-1оксипент-3-енил)-1,4-нафтохинона) и его производных среди них являютсякорни Echium russicum J.F. Gmel.
(Дайронас Ж.В.: дис. … канд. фармац. наук,2008). Дальнейшее развитие этого направления исследований позволило разработать технологическую схему выделения СО шиконина, составить и внедритьв работу фармацевтического предприятия лабораторный регламент производства данного соединения. Технология основана на способности данного нафтохинона в зависимости от рН среды находиться в форме основания, хорошо растворимого в неполярных средах, или соли, образованной с участием фенольного гидроксила и хорошо растворимой в воде (рисунок 1).OHOOOH-OOH+ OH++HH3COHOH3CCH3O-CH3OРисунок 1 – Строение шиконина в основной и солевой формахФизико-химические свойства и характеристики полученного шиконинасопоставимы с таковыми достоверного образца компании Sigma-Aldrich(CAS N 54952-43-1), выделенного из корней видов рода Arnebia, сем.Boraginaceae), что позволило установить показатели и нормы его качества (таблица 1).19Таблица 1 – Нормы качества СО шиконинаНаименование показателяНормаВнешний видКристаллический порошок тёмно-красного цветаРастворимостьЛегко растворим в спирте, эфире, хлороформеПодлинностьЯМР-1 Н-спектр СО шиконина в ацетоне долженсодержатьтолькосигналы,соответствующиеэталонномуУФ-спектр 0,002 % раствора Б шиконина-СО вхлороформе должен иметь в области от 250 до 600 нммаксимумы поглощения при (273 ± 2) нм, (492 ± 2) нм,(525 ± 2) нм, (565 ± 2) нмУдельный показатель1%поглощения A1см422-438Температура плавления, °С143-147Вода, % не более0,5Химическая чистота, %не менее99,5Наличие СО шиконина, изучение его хроматографических и спектральных характеристик послужило основой для усовершенствования разработанныхнами методик качественного и количественного анализа шиконина и его производных в ЛРС.Установлена специфичность процедуры анализа подлинности корней синяка русского при определении нафтохинонов с использованием реакции окрашивания, ТСХ, УФ-спектрофотометрии.
По результатам оценки линейности,специфичности, правильности, повторяемости, межоперационной точности методика количественного определения содержания суммы нафтохинонов в корнях синяка русского в пересчете на шиконин и абсолютно сухое ЛРС спектрофотометрическим методом соответствует критериям приемлемости.Принципиально другой подход к анализу нафтохинонов потребовалсяпри изучении юглона и содержащего его ЛРС.
Структурные особенности этогосоединения, в частности, способность образовывать гликозидные и сложноэфирные производные, димеры и тримеры, окисленные и восстановленныеформы в редокс-системе «нафтохинон – гидрохинон – нафтосемихинон» послужили препятствием для выделения индивидуального вещества из ЛРС. В результате оптимальным способом получения СО юглона оказался его синтез из201,5-нафталиндиола, который проводили совместно с Д.
Д. Винюковым на базеООО «Сигмабиосинтез» (Россия). Суть метода составляет окисление1,5-нафталиндиола кислородом воздуха c использованием катализатораS-(2-этил-полистирол)-N1,N4-бис(салицилиден)изотиосемикарбазоната кобальта (II), иммобилизованного на полимерном носителе (рисунок 2).OOH[O],CoOHNNHNSOnOHOHOРисунок 2 – Схема синтеза юглонаФизико-химические и органолептические показатели полученногоСО юглона совпали с данными достоверного образца компании Sigma-Aldrich(CAS N 481-39-0), что позволило определить показатели и нормы его качества(таблица 2).Таблица 2 – Нормы качества СО юглонаНаименование показателяНормаВнешний видКристаллический порошок жёлто-оранжевого цвета, легкосублимируемыйРастворимостьМало растворим в воде, растворим в спирте, диэтиловомэфире, хлороформеПодлинностьЯМР-1 Н-спектр СО юглона в ацетоне должен содержатьтолько сигналы, соответствующие эталонномуУФ-спектр 0,002 % раствора Б юглона – СО в этаноле 96 %в области от 220 до 500 нм имеет максимумы поглощенияпри (250 ± 2) нм, (410 ± 2) нмТемпература плавления, °С155-156Вода, % не более0,5Химическая чистота, %не менее99,5Применение полученного нами СО юглона в дальнейших исследованияхпослужило основой для разработки и валидации унифицированных методик качественного и количественного анализа юглона в ЛРС видов рода Juglans.Для подтверждения обоснованности выбора методики качественного анализа юглона в листьях ореха чёрного оценивали специфичность процедуры при21определении нафтохинонов методом ТСХ.
Результаты валидационной оценкилинейности, специфичности, правильности, повторяемости, межоперационнойточности методики количественного определения содержания суммы нафтохинонов в ореха грецкого листьях и ореха черного листьях цельных, измельчённых и порошке «ангро», в пересчете на юглон и абсолютно сухое ЛРС фотоколориметрическим методом соответствуют критериям приемлемости.Стандартизация ЛРС представителей сем. BoraginaceaeПо результатам скрининга на наличие нафтохинонов частей растенийсем. Boraginaceae интерес для дальнейшего исследования представляют корнивидов рода Echium, трава и корни видов рода Onosma.Шиконин и его эфиры локализуются в корнях видов сем.
Boraginaceae впокровной ткани, что наблюдается как при анализе внешних признаков (цветнаружной поверхности), так и микроскопических: клетки с красным содержимым перидермы корня (рисунок 3), в траве – в клетках паренхимы и флоэмы вобласти главной жилки листа (рисунок 4).1 – поперечный срез корня, 2 – кора корняЦена деления микролинейки 0,01 мм.Рисунок 3 – Микропрепарат корня Echium plantagineum (А), E.
vulgare (Б),E. russicum (В).221 – трихомы, 2 – поперечный срез листа. Цена деления микролинейки 0,01 мм.Рисунок 4 – Микропрепарат листа Onosma armeniaca Klok. ex M. Pop. (А),O. caucasica Levin ex M. Pop. (Б), O. sericea Willd. (В)Основным выявленным анатомо-диагностическим признаком травы видов рода Onosma является характер трихом на листовой пластинке – преимущественно эмергенцеподобных волосков, биометрические параметры которыхразличны для исследуемых видов.Подтверждено наличие нафтохинонов (шиконина и его эфиров) в корняхEchiumplantagineum L.,E. russicum J.F.