Б. Альбертс, А. Джонсон, Д. Льюис и др. - Молекулярная биология клетки (djvu) (1129766), страница 72
Текст из файла (страница 72)
Хотя эти петли обычно слишком малы и хрупки, чтобы их можно было легко наблюдать в световои микроскоп, можно обнаружить их наличие с помощью других методов. )!анример, стало возможно оценить частспу, с который лкзбые два локуса интерфазной хромосомы контактируют друг с другом, и таким образом определить вероятные потенциальные участки на хроматине, которые формируют сильно сближенные основания нетельных структур (рнс. гг.56). Эти и другие эксперименты дают возможность предположить, что Д! )К в хромосомах человека организована в петли различной длины. Типичная петля может содержать от 50 000 до 200 000 пар нуклеотидов ДНК, хотя допустимым и вполне возможным пределом является миллион нар нуклеотидов (рис. 4.57).
СПАРЕННЫЕ ХРОМОСОМЫ ТИПАЛАМПОВЫХ ЩЕТОК О О х НЕБОЛЬШАЯ ОБЛАСТЬ ХРОМОСОМЫ." ВИДНЫ СЕСТРИНСКИЕ ХРОМАТИДЫ хромати соедини соседние хромом омер, образованный ьно уплотненным 4.4.2, Попитенные хромосомы иак ничто иное пригодны дпя демонстрации структур хромзтинз Некоторые гигантские клетки насекомых выросли до своих огромных размеров за счет многократных циклов синтеза ДНК, не сопровождавшегося делением клет ки. Такие клетки г комнлемегпом ДНК, превышакицим нормальный, являются, как говорят, полиплоидными и содержат повышенное число стандартных хромосом.
Но у личинок мухи в секрегорных клетках нескольких типов все гомологичные копии хромосом удерживакпся бок о бок, подобно соломинкам для питья в коробке, и об разуют отделыпке крупные политенные хромосомы. ! 1оскольку в некоторых случаях политенные хромосомы могут распасться и дать начало обычной полиплоидной клетке, эти два состояния хромосом близко связаны между собой. Поэтому внутренняя струк тура политенной хромосомы должна быть подобна таковой нормальной хромосомы.
Рислй55. Модель структуры кромосомы типа ламповой щетки. Набор хромосом типа ламповой щетки у многих земноводных содержит в общем около 10 000 хроматиновых петель, хотя основная доля ДНК во всех хромосомах остается в вькококонденсированной форме и пребывает в хромомерах Каждая петля соответствует определенной последовательности ДНК. В каждой клетке имеется по четыре копии каждой петли, так как каждая из двух главных единиц, показанных в верхней части рисунка, состоит из двух сильно сближенных недавно реплицированных хромосом. Такая четырехнитевая структура характерна для этой стадии развития ооцита [диплотенная стадия мейоза1; см.
Рис. 21те ДНК-связывающий обйатоеан4'е белок поперечной сшивки ""'.l.« НАРЕЗАНИЕ РЕСТРИКТАЗО(~ ОБРАБОТКА ФОРМАЛЬДЕГИДОМ ДНК-зонды, используемые дпя ПЦР г« ,ь « УДАЛЕНИЕ ПОПЕРЕЧНЫХ СШИВОК ТЕРМООБРАБОТКОЙ И ПРОТЕОЛИЗОМ ИДЕНТИФИКАЦИЯ СОЕДИНЕННЫХ СЕГМЕНТОВ ПОСРЕДСТВОМ ПЦР днкчгрг«вмт пррвчдвтсх) только;в том . , спич«в евгщ «'кгвввв'бвтевудерживап, етндве ДНКг(юрв»«доеат«э«авютя в напоаредотвеййвй б(«гасфти друг ьт друга Рис. 4.56. Метод определения положения петель в интерфазных кромосомак. В этой методике, известной пгщ названием метода ЗС (сагогпоэопте соя(оггпасюп сортоге; захват конформации хромосомы), клетки обрабатывают формальдегидом, чтобы создать обозначенные на рисунке ковалентные поперечные сшивки типа ДНК-белок и ДНК вЂ” ДНК.
Затем ДНК обрабатывают нуклеазой рестрикции, которая нарезает ее на множество кусочков, производя разрезы в строго определенных последовательностях нуклеотидов и формируя наборы идентичных «липких концов» (см. рис. В.З4). Липкие концы могут соединиться друг с другом за счет комплементарного спаривания оснований, Важно, чтобы перед показанным шагом лиги рова н ия ДНК находилась в растворенной форме, с тем чтобы фрагментьь которые поддерживались в близком соседстве друг с другом (при помощи поперечных сшивок), соединились с наибольшей вероятностью. Наконец, поперечные сшивки разрушаются, и недавно лигированные фрагменты ДН К идентифицируют и определяют их количество при помощи ЛЦР (полимера зная цепная реакция, описанная в главе 8).
Объединив информацию о частоте контактов сегментов ДНК, полученную ЗС-методом, с информацией о последовательности ДНК, можно построить структурные модели конформации интерфаэных хромосом. Политения была лучше всего изучена в клетках слюнных желез личинок плодовой мушки дрозофилы.
Когда такие политенные хромосомы рассматривактг в световой микроскоп, заметны отдельные чередующиеся темные полосы, нли дп ски, и светлые междисковьге учгтстки (рис. 4.58), каждый из которых образован нз тысяч идентичных последовательностей ДНК, расположенных в ряд бок о бок. 11риблизнтельно 95'. ДНК в политенных хромосомах находится в дисках, а 5 ь— в междисковых промежугках. Очень тонкая полоса может содержать 3000 пар нуклеотидов, тогда как толстая полоса может содержать 200 000 пар нуклеотидов в каждой из своих хроматиновых нитей.
Хроматин в каждом диске выглядит тем ным, потому что в них ДНК уплотнена сильнее, чем ДГГК в междисковых участках; к тому же в диске может содержаться более высокая доля белков (рпс. 4.59). петлеобрвзный домен модифицирующие гистоны Ферменты комплексы перестрой хроматина РНК-полимервза белки, образующие ось хромосомы Рис.4.$7. Модель организации интерфззной хромосомы.
Схематическое изображение участка интерфззной хромосомы, имеющего летел ьную организацию. Каждый из ветл еобрззных доменов содержит, возможно, 50 000-200 000 пар нуклеотидов двойной спирали ДН К, конденсированной в 30-нм фибриллу. Хромзтин в каждой отдельной петле еще более конденсировзн благодаря пака еще недостаточно понятым процессам фолдингз, которые обращаются вспять, когда клетка требует прямого доступа к ДНК, упакованной в петле. Ни состав постулированной хромосомной оси, ни то, кзк свернутая 30-нм фибрилла закрепляется нз ней, не ясны.
Однако в митотических хромосомах основания хромосомных петель обогащены и конденсинзми, и ферментами ДНК-топоизомерзззми  — двумя белками, которые могут формировать во время метзфззы большую часть оси Гсм. рис. 4.74). В полном наборе политенных хромосом дрозофилы насчитывается прнблизи тельно 3700 полос и 3700 междисков.
Полосы могут быть идентифицироваггы по их различной толщине и разным промежуткам в их взаимной разбивке, и каждой из них был присвоен номер, чтобы построиты карту» хромосом„которая была индексиро вана в соответствии с секвенированной последовательностью генома этой мухи. Политенные хромосомы дрозофилы служат хорошей отправной точкой для изучения организации хроматина высокого уровня. В предыдущем параграфе мы увидели, что существует много форм хроматина и каждая из них содержит нуклео сомы с различной комбинацией модифицированных гистонов.
В ходе считывания такого гистонового кода определенные наборы негистоновых белков собираются на нуклеосомах и влияют на биологическую функцию тем или иным образом. Некого рые из этих негистоновых белков могут распространяться по ДНК на значительные расстояния, сообщая подобную структуру хроматина смежным областям гегюма (см. рис. 4А6).
Так, в некоторых областях весь хроматин имеет подобную структуру и отделен от соседних доменов барьерными белками (см. рис. 4А7). Поэтому при низком разрешении интерфазная хромосома может рассматриваться как чересполоси ца структур хроматина, каждая из которых содержит специфические модификации нуклеосом, сопряженные со специфическим набором негистоновых белков. (При более высоком уровне разрешения в глаза бросается множество специфичных к по следовательности ДНК.связывающих белков, которые будут описаны в главе 7).
Такая картина итперфазнойг хромосомы помогает нам интерпретировать резуль таты, полученные в ходе исследований политенных хромосом. Путем окрашивания высокоспецифичными знтителами можно показатгь что на разных дисках политенных хромосом гистоны модифицированы по-разному (рис. 4.60), а также различны наборы негистоновых белков. Зто наводит на мысль о мощной общей стратегии. Применяя сочетания антител, прочно связывающихся с соответствующими модификациями гистонов, которые создают гистоновый код (см.
рис. 4.39), можно определить, какие правое плечо хромосомы 3 ч Х-хромосома хф" г нормальные митотические ® г',а. 4)()г я,ч ) хромосомы в том же тф уу аян' '1 — ' масштабе увеличения М ---"'в~ъ-~-"=-- Ф 'В,-"., ЯЩ„. Ф Я~ЩД фтй~~, т ° правое плечо левое плечо хромосомы 3 „., ъ«хромосомы 2 Ф~ та« 20 мкм Рис. 4.5В.
Полный набор политвннык хромосом из плетки слюнной железы Ргозорлззо лгеаглодазгег. На втой иллюстрации, полученной на световом микроскопе микрофотоснимка, гигантские хромосомы для большей наглядности расправлены на предметном стекле и прижаты покровным стеклом — «раздавлены». Дрозофила имеет четыре хромосомы, и четыре различные пары хромосом представлены. Но каждая хромосома крепко спарена со своим гомологом (так что каждая пара выглядит как единая струкгура), что не свойственно большинству ядер (разве только во время мейоза). Каждая хромосома подверглась многократным циклам репликации, и гомологи, а также все их дубликаты остались в точном строевом порядке друг с другом, в результате чего образовались огромные хроматиновые канаты, состоящие из множества нитей ДНК.
Все четыре политенные хромосомы обычно связаны друг с другом гетерохроматиновыми областями около своих центромер, которые объединяются и образуют единый большой хромоцентр (розовая область). Однако в зтом препарате хромоцентр был раздроблен на две части при процедуре «раздавливанияь (Переработано на основе Т. 5. Ра(птег, 2 Негес(. 25: 465-476, 1934. С любезного разрешения издательства Ох(огд Огйуепйту Ргем.) междисковыв а) 2 мхм Рис.4.59. Микрофотографии палитенных хромосом в слюнных желеэах ОгожуэЬгйг лм)олодазтег а) Полученный на оптическом микроскопе микрофотоснимок участка хромосомы.
ДН К была окрашена флуоресцентным красителем, но здесь представлено обращенное изображение, в котором белые участки ДНК выглядят черными; ясно видно, что диски являются областями повышенной концентрации ДНК. Эта хромосома была обработана при высоком давлении, побы отличающий ее профиль распределения полос и междисковых промежутков проявился более четко. б) Электронный микрофотоснимок маленького участка политенной хромосомы Лрозофилы, наблюдаемого в тонком срезе. Легко различимы полосы, сильно отличающиеся по толщине и отделенные междисковыми промежутками, в которых хроматин находится в менее конденсированной форме. (Иллюстрация а переработана из О.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
