Osnovy_biokhimii_Nelson_i_Kokh_tom_1 (1123313), страница 167
Текст из файла (страница 167)
10.4. Методы анализа липидов Поскольку липпды нерастворимы в воде, их экстракцня и последующее разделение требуют использования органических растворителей н некоторых методик, которые нс применявтся при очистке водорастворимых веществ, таких как белки нли углеводы. Общий подход к разделению сложных смесей липидов основан на различиях в нх полярности или растворимости в неполярных растворителях. Лля последующего анализа липиды, которые содержат жирные кислоты, связанные сложнозфирной нли амидной связью, можно гидролнзовать, обработав кислотой, щелочьв или высокоспецифичными гндролитическими ферментами (фосфолнпазы, гликозидазы). Некоторыс методы, широко применяемые для анализа липидов, представлены на рис.
10-24 и обсуждаются ниже. ][ля зкстракции липидов требуются орсанические растворители Нейсрзльныелипиды (триацилглицериды, носки, пигменты и др.) легко экстрагируются из тканей этнловым эфиром, хлороформом или бепзолом, растворителями, которые не допусюнот ассоциапнн липидов, обусловленной их гидрофобными свойствами. Мембранные липиды эффективнее зкстрагируются более полярными растворителями, такими как этанол или метанол, которые уменьшают гидрофобные взаимодействия между липидпыми молекулами, ослабляя в то жс время водородные связи и электростатические взаимодействия, связывающие мембранные липиды с мембранными белками.
Наиболее часто применяемым экстракционным агентом янляется смесь хлороформа, метанола и воды в соотношении (1:2:0,8 по объему). В этом соотношении растворители хорошо смешиваются, образуя одну фазу. После того как ткань гомогенизируют в растворителе для экстракции всех липидов, к полученному экстракту добавляют некоторое количество воды, н смесь расслаивается на две фазы — водно-метапольную (верхняя фаза) н хлороформенную(нижняя фаза). Липиды остаются в хлороформенпом слое, а более полярные молекулы, такие как белки и сахара, попадают в водно-мстанольный слой. Методом адсорбционной хроматографии разделяют липиды разной полярности Сложные смеси тканевых липидов можно разделить на фракции с помощью хроматографических методов, основанных на различной полярности липидов разных типов.
В адсорбционной хроматографии (рис. 10-24, б) нерастворимый полярный материал, такой как силикагель (форма кремниевой кислоты 81(ОН),), помешают н стеклянную колонку, а смесь лнпидов (в виде хлороформенного раствора) добавляют в верхнюю часть колонки. (При высокоэффективной жидкостной хроматосрафии колонка меньшего диаметра, а растворители продавливаются через колонку под высоким давлением.) Полярные липиды прочно связываются с полярной кремневой кислотой, нейтральные же липиды проходят через колонку и выходят при первой промынке хлороформом. Затем вымываются полярные липиды, опи выходят в порядке увеличения полярности при промывании колонки растворителями с постепенно возрастающей полярностью.
Незаряженные, но полярные липиды (например, цереброзиды) вымываются ацетоном, а очень полярные или заряженные липиды (такие как глицерофосфолипиды) элюируются метанолом, В тонкослойной хроматографии на кремневой кислоте используется тот же принцип (рис.10-24, в). Тонкий слой силикагеля распределен по стеклянной пластинке, к которой он прилипает. Небольшое количество липидов, растворенных в хлороформе, наносят близко к [516[ Часть1. 10. Липиды Ткань / а Вода Метанол/вода Хлороформ б Алсорбционнал [ хроматография ', »' Тонкослойнал хроматография 123456789 В МаОН/метанол Метилоаые эфиры жирных кислот д ' -;::»,'=,".;::::!» е Гааожидкосгная Высокоэффективная хроматография жилкостная хроматография Ю 18;О 16;1 Время элюции о о В о .с о ' и ш о ст к Ь и о ьс гомогсииаироваиа в смеси хлоро4юрм/метанол/воЛа Рис.
10-2Ф. Обычные процедуры при зкстракции, разделении и идентификации клеточных липидов. а) Ткань гомогениэируют в смеси хлороформ/метанол/вода. После добавления воды и удаления неэкстрагируемого осгдка центрифугированием получаются две фазы.
Различные типы экстрагированных липидов в хлороформенной фазе могут быть разделены адсорбционной хроматографией (б) на колонне из силикагеля, через которую пропускаются растворители с увеличивающейся полярностью, или (в) с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ), когда липиды переносятся восходящим фронтом растворителя вверх по пластинке, покрытой силикагелем, при этом менее полярные липиды проходят дальше, чем более полярные или заряженные.
При использовании подходящих растворителей ТСХ можно применить ддя разделения родственных липидов; например, заряженные липиды фосфатидилсерин, фосфатидилглицерин и фосфатидидинозит легко разделяются методом ТСК. Для определения состава жирных кислот липидная фракция, содержащая связанные сложноэфирной связью жирные кислоты, переэтерифицируется в горячем водном растворе НаОН и метанола (г) для получения смеси метиловых эфиров жирных кислот. Эти метиловые эфиры затем разделяют по длине углеродной цепочки и степени ненасыщенности методом (д) газожидкостной хроматографии (ГЖХ) или методом (е) высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Определение молекулярной массы с помощью масс-спектрометра делает возможным однозначно идентифицировать индивидуальные липиды. краю пластинки, которую погружают в плоский контейнер с органическим растворителем нлн смесью растворителей. Все зто находится внутри камеры, насыщенной парами растворителя.
Поднимаясь ио пластинке вследствие каинлляриого аффекта, растворитель несет с собой липиды. Менее полярные лнинды иродниииотся дальше, так как они обладают меньшим стремлением к связыванию с кремниевой кислотой. Разделенные липиды можно обнаружить, опрыскивая пластинку красителем (родвмииом), который флуоресиирует при связывании с липндамн, нлн выдерживая лнпнды в парах иода.
Иод обратимо реагирует с двойными связями в жирных кислотах, так что лнпнды, содержащие ненасыщенные жирные кислоты, дают желтую нли коричневую окраску. Для обнаружения специфических лниидов используется ряд других реагентов. Для последующего анализа участки, содержащие разделенные лнинды, соскабливают с пластинки, н вновь зкстрагируют лнпиды органическим растворителем. 10.4 Методы анализа липидов [517] Методом газожидкостной хроматографии разделяют смеси летучих производных липидов Методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ) разделяют летучие компоненты смеси н соответствии с их относительной способностью растворяться в инертном материале, наполняющем хроматографическую колонку, улетучиваться и двигаться через колонку с потоком инертного газа, например гелия.
Некоторые липиды летучи от природы, но болыпинство приходится сначала подвергать превращению в производные с увеличенной летучестью (т. е. более низкой температурой кипения). Для анализа жирных кислот образец фосфолипидов сначала нагревают в смеси метанол/НС1 или метанол/)чаОН, при этом жирные кислоты, связанные сложноэфирной связью с глицерином, превращаются в метиловые эфиры (происходит переэтерификация; рис. 10-24, г). Эти метиловые эфиры жирных кислот затем загружают в газожидкостную хроматографическую колонку, колонку на~ревают, чтобы сделать компоненты летучими. Эфиры жирных кислот, которые лучше растворяются в материале, наполняющем колонку переходят в раствор; менее растворимые липиды уносятся потоком инертного газа и первыми выходят из колонки. Порядок элюиронапия зависит от природы твердого адсорбента в колонке и от температуры кипения компонентов липидной смеси.
Таким образом удается полностью разделить на компоненты смеси жирных кислот с различной длиной углеродпой цепи и различной степенью непасыщенпости (рис. 10-24, д). Специфический гидролиз помогает определить структуру липида Некоторые классы липилов при определенных условиях подвергаются деградации. Например, вге жирные кислоты, связанные сложноэфирной связью в триацилглицеридах, фосфолипидах и эфирах стеринов, высвобождаются посредством мягкой обработки кислотами или щелочами, а при несколько более жестких условиях гндролизз высвобождаются связанные амидной связью жирные кислоты из сфинголипидов.
Ферменты„ которые специфически гидролизуют определенные липиды, также используются при установлении структуры липида. Каждая из фосфолипаз Л, С и О (рис. 10-16) расщепляет определенные связи в фосфолипидах с образованием продуктов, обладающих характерными растворимостью и хроматографнческим поведением.
Например, фосфолипаза С высвобождает растворимый н воде фосфорилиронаппый спирт (так, из фосфатидилхолина получается фосфохолин) и растворимый в хлороформе диацилглицерин. Каждый из них можно охарактеризовать по отдельности для определения структуры исходного фосфолипида. При комбинации специфического гидро- лиза и анализа пр<щуктон гидролиза с помощью методов тонкослойной, газожидкостной или высокоэффективной жидкостной хроматографии часто удается расшифровать структуру липида. Методом масс-спектрометрии можно полностью расшифровывать структуру липида Для однозначного определения длины углеводородной цепочки или положения двойных связей применяют метод масс-спектрометрического анализа липидов или их летучих произяодных.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
