Biokhimia_T3_Strayer_L_1984 (1123304), страница 41
Текст из файла (страница 41)
А.[Wellauer P. К.,Dawid I. В.,Proc. Nat. Acad. Sci., 70, 2828(1973).]сет на 3 -коние длинную poly(А)-последовательность.4. ЭукариотическиемРНКмоноцистронны, т.е. они являются матрицами длясинтеза только одной полипептидной цепи.Многие прокариотические мРНК, наоборот, полицистронны (например, мРНК лактозного оперона - матрица для синтеза трехполипептидных цепей).5. Популяция молекул мРНК эукариотической клетки зависит не только от скороститранскрипции определенных генов; в эукариотических клетках имеется и еще одинуровень принятия решений; должен ли тотили иной первичный транскрипт подвергнуться деградации или процессингу с образованием зрелой мРНК и последующимтранспортом ее в цитозоль1.29.22.
На 5'-конце мРНК находятся«колпачки», а на 3'-конце, как правило,poly(А)-последовательности5'-конец всех известных эукариотическихмРНК (но не тРНК или рРНК) модифицирован особым образом. К мРНК присоединен 7-метилгуанилат необычной пирофосфатной связью 5'—5' (рис. 29.32). Этахарактерная структура называется «колпачком». Она присоединяется к первичномутранскрипту.
5'-трифосфатный конец новообразованной цепи гидролизуется до дифосфата, и на него переносится остаток гуанилата GTP. Затем N-7 этого концевогогуанина метилируется S-аденозилметиони-Рис. 29.31.ОбразованиерибосомнойРНК млекопитающих из первичного транскрипта. Спейсерныеучасткипоказаныжелтым.]Следует указать еще одно важное отличиепрокариотических мРНК от эукариотических —время жизни. У прокариот оно составляет неболее нескольких минут, а у эукариот - десяткиминут или часы, а в исключительных случаяхнедели и месяцы.- Прим. перев.29.
Хромосомы и выражениегенов у эукариот149в эукариотических системах синтеза белка.Кроме того, большинство эукариотических мРНК имеет на 3'-конце poly(А)-последовательности. Роlу(А)-полимераза присоединяет 150-200 нуклеотидов к первичномутранскрипту, на 3'-конце которого расположен динуклеотид GC, а на расстоянии примерно 20 нуклеотидов от него - последовательность A A U A A . Исследования различных мРНК, введенных в яйца Xenopus,показали, что роlу(А)-фрагмент увеличивает стабильность мРНК, но при этом неимеет никакого значения для трансляции.Кроме того, отсутствие poly(А) на конце гистоновых мРНК показывает, что он не обязательно должен присутствовать в мРНКдля ее транспорта из ядра в цитозоль.Рис.
29.32.Структура «колпачков», расположенных на 5'-конце эукариотических мРНК. Все «колпачки» содержат 7-метилгуанилат(изображен синим цветом),присоединенный пирофосфатной связью к 5'-концу. В «колпачке» 0 ни одна рибоза не метилирована,в«колпачке»1 метилирована одна рибоза,в «колпачке» 2 - две.ном и образуется так называемый «колпачок» 0. Соседние остатки рибозы могутбыть метилированы, при этом образуется«.колпачок» 1 или «колпачок» 2 (рис. 29.32).Эти «колпачки» способствуют стабилизации мРНК, защищая их 5'-концы от фосфатаз и нуклеаз.
Кроме того, «колпачки» повышают эффективность трансляции мРНК150Часть IV.Информация29.23. Ферменты сплайсинга с высокойточностью удаляют интроны из первичныхтранскриптов разорванных геновПри сплайсинге (расщепление с последующим сращиванием) мРНК происходит разрыв двух фосфодиэфирных связей и образование одной новой.
Эндонуклеазнаяи лигазная активности, вероятно, содержатся в одном ферментном комплексе, и последовательные реакции сплайсинга согласованы между собой. В настоящее времямногие лаборатории пытаются выделитьферменты сплайсинга. Очевидно, их действие должно обладать высокой точностью.Ошибка в точке сплайсинга на один нуклеотид приведет к сдвигу рамки считыванияв сторону 3'-конца от этого места, что дастсовершенно иную последовательность аминокислот. Как ферменты сплайсинга узнаютсвои мишени? В настоящее время известенряд нуклеотидных последовательностейв месте стыка экзонов и интронов, кодирующих РНК-транскрипты (табл.
29.7). В этихпоследовательностях есть общий мотив: интрон начинается с GU и кончается AG. Следует отметить, что один и тот же сигналсплайсинга встречается у кур, кроликов, мышей и в ДНК вируса SV-40, который заражает клетки обезьян и человека 1 .1В последнее время получен ряд данных, свидетельствующих об участии т.н. низкомолекулярных ядерных РНК в сплайсинге, а такжев созревании 3'-концов РНК. Эта фракция РНКисследуется уже давно.
Она весьма консервативна и содержит последовательности, комплементарные участкам экзонов, прилежащим к интронам. Низкомолекулярные ядерные РНК, по-видимому, обеспечивают узнавание участковсплайсинга соответствующими ферментами. Прим. перев.Таблица 29.7.
Последовательности оснований транскриптов, содержащих интроны, вблизи участков сплайсингаУчасток генаЭкзонИнтронЭкзонОвальбумин, интрон 2Овальбумин, интрон 3β-Глобин, интрон 1β-Глобин, интрон 2Иммуноглобулин λ 1 , интрон 1Ранний Т-антиген вируса SV-40В молекулах транспортной РНК точкисплайсинга окружены совершенно другимипоследовательностями. Из этого, очевидно,следует, что существует по крайней мере двафермента сплайсинга: один для образования мРНК, другой - тРНК. Процесс сплайсинга тРНК, по-видимому, очень сходену эволюционно далеких видов.
Клонированные гены одной из дрожжевых тРНКвводили в ооциты Xenopus с помощью микроинъекции для того, чтобы выяснить, может ли ген одноклеточного эукариота транскрибироваться, а его продукт - процессироваться в клетке амфибии. Самое поразительное, что в клетке Xenopus происходяттранскрипция дрожжевого гена и правильный процессинг его продукта, несмотряна то что гены этой тРНК у двух видов совершенно различны.
В частности, 14-нуклеотидная вставочная последовательность правильно удаляется (рис. 29.33). Итак, специфичность ферментов сплайсинга сохранилась на протяжении огромного периодаэволюции.29.24. В настоящее время известныпоследовательности оснований многихинформационных РНКМногие эукариотические мРНК были выделены в очищенном виде. У некоторых из нихбыла определена последовательность оснований.
Выделение какой-либо мРНК начинается с выбора клеток, в которых она содержится в большом количестве. Например,ретикулоциты богаты глобиновой мРНК,яйцеводы кур - мРНК овальбумина, плазматические клетки - мРНК иммуноглобулинов, эмбрионы морского ежа - мРНК гисто-нов. Выделение мРНК начинается с получения клеточного экстракта, из которогоудаляют белки и ДНК. Затем большуючасть мРНК отделяют oт других видовРНК, используя наличие в них poly(А)-фрагментов.
Эти мРНК прочно связываютсяс колонками, содержащими ковалентно привязанныеполинуклеотидыpoly(U)и poly(Т). После элюции с такой аффиннойколонки мРНК ее можно фракционироватьпо размеру молекул методом гель-электрофореза или седиментации. Другой способвыделения индивидуальной мРНК - иммунопреципитация. Например, если добавитьв белоксинтезирующий экстракт антитела,специфичные к овальбумину, это переведетв осадок полисомы, содержащие овальбуминовую мРНК.
Для того чтобы проверитьпрепарат мРНК, его добавляют в бесклеточную систему синтеза белка, которая работает только в присутствии экзогеннойРНК. Для этого часто используются экстракты проростков пшеницы.Наличие очищенных индивидуальныхмРНК открывает возможности для ряда интересных экспериментов. Во-первых, с помощью метода гибридизации соответствующей мРНК (или комплементарной ейДНК-копии) с хромосомной ДНК можноопределить число определенных генов в геноме. Во-вторых, можно идентифицироватьфрагменты ДНК, содержащие данный ген,гибридизуя их с мРНК. Затем эти фрагменты можно клонировать (разд.
31.11),чтобы получить сам ген и прилегающиек нему участки хромосомы в большом коли29. Хромосомы и выражениегенов у эукариот151Рис. 29.33.Процессингпредшественника дрожжевой тирозиновойтРНК. Происходит удаление14-нуклеотидной вставочнойпоследовательности (показаножелтым цветом), и ряд оснований модифицируется. Продуктдлиной 92 нуклеотида получается из первичного транскрипта длиной 108 нуклеотидов путем отщепления 5'-концевой лидерной последовательности и присоединенияССА к 3'-концу.честве. В-третьих, с помощью электронноймикроскопии можно выявить вставочныепоследовательности в этом гене (разд.26.12). В-четвертых, можно определить последовательностьнуклеотидовмРНК,чтобы идентифицировать регуляторные сигналы.Недавно была определена последовательность овальбуминовой мРНК.
Эта мРНКсодержит 1859 нуклеотидов на участке от«колпачка» на 5'-конце до p o l y ( A ) на 3'-кон152Часть IV.Информацияце (рис. 29.34). 1158 нуклеотидов, кодирующих белок, обрамлены с обеих сторон нетранслируемымипоследовательностями.С 5'-стороны она короче, чем с 3'-стороны.Нетранслируемый 5'-концевой участок длиной 64 нуклеотида содержит «колпачок»,инициирующий кодон AUG, взаимодействует с белоксинтезирующим аппаратоми участвует в инициации синтеза белка.Весьма многозначителен тот факт, что этотучасток содержит последовательность, комплементарную 3'-концу 18S-pPHK. Напомним, что у прокариот инициирующая последовательностьвмРНКспариваетсяс 3'-концом 16S-pPHK (разд.
27.14). Рольочень длинной нетранслируемой последовательности, расположенной с 3'-стороны, неизвестна. Для этого участка длиной 637 нуклеотидов характерно обилие короткихповторяющихсяпоследовательностей.Фрагменту poly(А) в овальбуминовоймРНК, как и в других мРНК, предшествуетGC, а примерно за 20 нуклеотидов доэтого - AAUAAA.29.25. Эукариотическая рибосома (80S)состоит из малой (40S) и большой (60S)субчастицАппарат синтеза белка у эукариот аналогичен соответствующему аппарату у прока-Рис. 29.34. Схема организации овальбуминовой мРНК курицы.риот, но составляющие его белки и РНК отличаются от прокариотических и, крометого, они содержатся в большем количестве.Цитоплазматические рибосомы эукариотических клеток несколько крупнее, чем рибосомы бактерий.
Эукариотические рибосомы(рис. 29.35) имеют коэффициент седиментации 80S, а не 70S. Подобно бактериальнымрибосомам, они диссоциируют на большую(60S) и малую (40S) субчастицы. 40S-субчастица содержит молекулу 18S-PHK и примерно 30 белков. Остальные три рибосомные PHK - 5S, 5,8S и 28S - локализованыв 60S-субчастице, в которую входит такжепримерно 45 белков.Стадии трансляции - инициация, элонгация и терминация - в основном сходны у эукариот и прокариот.
Однако в некоторыхчастностях механизмы реакции различаются. Так, эукариоты используют для инициации особую тРНК (она называетсяmPHKiMet ), но она у них не формилируется.Эукариоты и прокариоты различаются также по чувствительности к некоторым ингибиторам трансляции. Циклогексимид ингибирует элонгацию только у эукариот, тогдакак эритромицин блокирует эту же стадиютолько у прокариот. Любопытно отметить,что рибосомы митохондрий и хлоропластовимеют больше общего с бактериальными рибосомами, чем с рибосомами окружающегоих цитозоля.
Кроме того, в митохондрияхи хлоропластах используется формилированная инициаторная тРНК, а их рибосомычувствительны к большинству ингибиторов,избирательно блокирующих трансляциюу прокариот.Рис. 29.36.Рис. 29.35. Электронная микрофотография эукариотических 80S рибосом. (Печатается с любезногоразрешенияд-раMiloslavBoublik.)Структура циклогексимида ингибитора стадии элонгациисинтеза белка у эукариот, но неу прокариот.29.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
