Biokhimia_T3_Strayer_L_1984 (1123304), страница 38
Текст из файла (страница 38)
В этих экспериментахДНК дробили на короткие фрагментыи затем денатурировали нагреванием раствора выше температуры плавления ДНК(Тпл). Затем полученный раствор одноцепочечной ДНК охлаждали до температурыпримерно на 25°С ниже Тпл, оптимальнойдля реассоциации комплементарных цепейс образованием двухспиральной ДНК. Кинетику реассоциации можно регистрировать самыми различными способами.Один из методов состоит в измерении поглощения раствора при 260 нм (разд.
24.9).При этой длине волны коэффициент поглощения двухцепочечной ДНК примерно на40% ниже, чем соответствующая величинадля одноцепочечной ДНК; это явление называется гипохромизмом. В основе другогоэкспериментального подхода лежит тотфакт, что двухцепочечная ДНК связывается колонками с гидроксиапатитом (фосфатом кальция), а одноцепочечная проскакивает. В этом методе привлекает то, что онпозволяет фракционировать большие количества ДНК на основе скорости ее реассоциации после тепловой денатурации.Наблюдаемая кинетика реассоциацииДНК Е.
coli или фага Т4 соответствуетожидаемой кинетике бимолекулярной реакцииРис. 29.17.Кривые зависимости f от C0t(«кривые C0t») отображают кинетику реассоциации нескольких денатурированных нагреванием ДНК. По оси ординатотложенадоляодноцепочечных молекул, по осиабсцисс - C0t. Быстрая реассоциация сателлитной ДНК мыши показывает, что она содержитогромноеколичествоповторяющихсяпоследовательностей.
[Britten R. J., Kohne D. E., Science, 161, 530(1968).]где S и S' - комплементарные одноцепочечные молекулы, D - реассоциировавшаядвойная спираль и k - константа скоростиассоциации. В такой реакции доля одноцепочечных молекул f снижается со временемв соответствии с уравнениемгде С0 - исходная концентрация ДНК (выраженная в молях нуклеотидов в 1 л),а t - время в секундах. Для определеннойДНК и заданных экспериментальных условий (т. е. ионной силы, температуры, размера фрагментов ДНК) f зависит только отC0t - произведения концентрации ДНК навремя.
Кинетику реассоциации удобно графически изображать, откладывая зависимость f от десятичного логарифма C0t. Такая кривая C0t имеет сигмоидную форму(рис. 29.17). Характеристикой того илииного препарата ДНК служит величинаC 0 t 0 , 5 , которую легко определить с по-мощью этой кривой. C 0 t 0 , 5 - значение C0t,при котором происходит реассоциация половины ДНК (f= 0,5). Для ДНК Е. coli значение C 0 t 0 , 5 составляет примерно 9 М•с,для фага Т4 C 0 t 0 , 5 = 0,3 М•с. Эти числапоказывают, что ДНК Е.
coli реассоциирует примерно в 30 раз медленнее, чемДНК фага Т4. Объясняется это тем, чтоДНК Е. coli длиннее и число разных видовфрагментов, которые содержатся в препарате ДНК, разрушенной силами сдвига,больше, чем в препарате ДНК Т4. Итак,концентрация комплементарных фрагментов в растворе фрагментированной ДНКЕ. coli ниже, чем в растворе ДНК фага Т4(содержащем такое же количество нуклеотидов), и, следовательно, скорость реассоциации ниже. Исследование ряда прокариотических ДНК показало, что величинаC 0 t 0,5 прямо пропорциональна размеру генома.Когда с помощью этого метода сталиисследовать ДНК мыши, получили неожиданный результат.
Геномы млекопитающих примерно на три порядка величиныбольше, чем геном Е. coli, и предполагалось, что будет получена величина C 0 t 0 , 54порядка10 М•с.РастворДНК-4с концентрацией 10 М и с такой величиной C0t0,5 должен реассоциировать наполовину за 108 с (примерно 3 года). К удивлению исследователей, они обнаружили,что 10% ДНК мыши реассоциирует наполовину за несколько секунд. Эта фракцияДНК мыши реассоциирует быстрее, чемдаже самые маленькие вирусные ДНК, и,следовательно, содержит много повторяющихся последовательностей. Анализ кри29.
Хромосомы и выражениегенов у эукариот139вой зависимости f от C0t показал, что этафракция мышиной ДНК содержит порядкамиллиона копий повторяющейся последовательности длиной около 300 пар оснований.Примерно 20% мышиной ДНК ренатурирует с промежуточной скоростью. Этотфакт, согласно интерпретации авторов,указывал, что данная фракция содержит3410 —10 копий определенных последовательностей. Остальные 70% мышинойДНК ренатурировали очень медленно. Величина C 0 t 0,5 для этой фракции показывала, что она состоит из уникальных или почти уникальных последовательностей оснований.Все изученные до настоящего времениэукариотические геномы, кроме, возможно,дрожжей, содержат повторяющиеся последовательности ДНК, тогда как прокариоты ее не содержат.
Например, человеческая ДНК на 30% состоит из последовательностей, повторяющихся по меньшеймере 20 раз. Относительное содержаниевысокоповторяющейся, умеренно повторяющейся и уникальной ДНК различноу разных видов.29.11. Высокоповторяющаяся ДНК(сателлитная ДНК) локализованав центромерахМногие высокоповторяющиеся ДНК можно выделить методом центрифугированияв градиенте плотности, так как их плавучаяплотность отличается от плотности основной ДНК.
Например, ДНК Drosophila virilisдает главный пик и три сателлитных пикас меньшей плотностью (рис. 29.18). Эти сателлитные пики содержат исключительноповторяющуюся ДНК. Каждая из нихпредставляет собой повторяющуюся последовательность гептануклеотидов:Роль высокоповторяющейся ДНК неизвестна. Но хромосомная локализацияэтой фракции была определена с помощьюметода гибридизации in situ, разработанного Джозефом Голлом и Мэри Лу Пардью(Joseph Gall, Mary Lou Pardue). Клетки иммобилизовали под тонким слоем агара140Часть IV.ИнформацияРис.
29.18.На этой кривой седиментациивидны три отчетливых пика сателлитной ДНК (ρ = 1,692,1,688 и 1,671). Показан результат равновесного центрифугирования ДНК D. virilis в нейтральномградиентеCsCl.[Gall J. G., Cohen E. H., Atherton D. D., Cold Spring HarborSymp. Quant. Biol., 38, 417(1974).]и обрабатывали щелочью для денатурацииДНК. Затем этот препарат инкубировалис меченной тритием РНК, транскрибированной in vitro очищенной сателлитнойДНК в качестве матрицы.
Гибриды радиоактивной РНК с участками хромосомы,содержащими сателлитную ДНК, выявлялиспомощьюрадиоавтографии(рис. 29.19). Был получен очень четкий результат: сателлитная ДНК мыши встречается только в области центромер. Локализация этих последовательностей и отсутствие в клетке комплементарных им РНКобъясняются, по-видимому, тем, что са-теллитные последовательности участвуютв перемещениях хромосом во время митоза и мейоза.29.12. Гены, кодирующие рибосомные РНК,расположены один за другим тандемнои повторяются несколько сот разГены, кодирующие молекулы рибосомныхРНК, отличаются двумя особенностями.Во-первых, они повторяются тандемноРис.
29.19.Радиоавтограф мышиных клеток, на котором видна локализация сателлитной ДНК. (Печатается с любезного разрешения д-ра Joseph Gall.)Рис. 29.20.Микрофотография ядра, выделенного из ооцита ксенопуса.Ядро окрашено, чтобы быливидны сотни ядрышек, образующихся при амплификациигеноврибосомнойРНК.[Brown D. D., Dawid I. В., Science, 160, 272 (1968).]один за другим. Почти у всех эукариотимеется более 100 копий этих генов. Во-вторых, большинство генов рРНК расположено в особых участках хромосом, ассоциированных с ядрышками.
В клетках мутантов,лишенных ядрышек, синтезируется оченьмало рРНК; поэтому они нежизнеспособны. Об этих генах многое известно,главным образом благодаря работам Мак-са Бернстила, Доналда Брауна, ОскараМиллера (Max Birnstiel, Donald Brown,Oscar Miller) и их сотрудников. Гены, кодирующие четыре рибосомные PHK - 18S-,5,8S-, 28S- и 5S-рРНК,- были выделеныв чистом виде из ДНК африканских шпорцевых лягушек Xenopus laevis и Xenopusmulleri. Выбор пал на шпорцевых лягушекпо той причине, что их ооциты содержатособенно много этих генов.Гены 18S-, 5,8S- и 28S-pPHK собранывместе (образуют кластеры) и тандемноповторяются.
Гибридизация in situ показала, что эти гены расположены в ядрышках.Повторяющаяся единица состоит из гена,кодирующего40S-предшественникРНКи спейсер (рис. 29.21). 40S-предшественник(8kb) модифицируется и расщепляется, давая зрелые 18S-, 5,8S- и 28S-рРНКРис. 29.21.Организация генов 40S-предшественника18S5,8Sи 28S-рРНК у ксенопуса. Тандемно повторяющиеся геныразделенынетранскрибируемыми участками (спейсерами). Длина повторяющегосяэлемента 13 kb.29. Хромосомы и выражениегенов у эукариот141Рис.
29.22.На этой электронной микрофотографии ядрышковой ДНКясно видна тандемная укладкагенов 18S-, 5,8S- и 28S-pPHK.Толстая осевая нить - ДНК.Тонкие нити, отходящие в стороны,- новообразованные молекулы РНК со связаннымибелками. Острый конец каждой«елочки», образованной синтезирующимисямолекуламиРНК, соответствует точке инициации транскрипции. Голыеучастки между острыми концами «елочек» - нетранскрибируемые спейсеры. [Miller О.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
