Ю.С. Ченцов - Введение в клеточную биологию. Общая цитология (1120992), страница 4

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 4)

Аналогичным путем можно в безъядерную зиготу млекопитающих ввести ядро из ткани взрослого животного и получить клонированную особь, имеющую идентичную генетическую информацию с животным-донором. Так была получена (клонирована) овечка Долли.

Из этого вытекает, что клетки многоклеточных организмов обладают полным набором генетической информации, свойственной для данного организма, в этом отношении они равнозначны. Но одновременно клетки отличаются по объему проявления этой информации, что и создает возможность появления специализированных клеток. Однако эти представления не могут быть приняты полностью, так как имеются исключения, показывающие, что при дифференцировке происходит количественное изменение генетического материала. Так, при дроблении яиц аскариды клетки, дающие начало соматическим тканям, теряют часть хромосомного материала (диминуция). Сходный процесс описан у насекомых-галлин. В этом случае при обособлении соматических ядер происходит значительная редукция хромосомного материала. При этом клетки половых зачатков содержат 40 хромосом, а соматические – всего 8. Следует помнить, что такие различия были обнаружены только между половыми и соматическими клетками; различий в хромосомных наборах между разными соматическими клетками не обнаружено. Однако в последнее время появились данные о том, что плазмациты, в результате специфической дифференцировки при иммунном ответе претерпевают молекулярные перестройки в области генов, ответственных за синтез антител, и тем самым генетически отличаются от остальных клеток.

Общим же законом для многоклеточных растительных и животных организмов является то, что несмотря на структурные и функциональные различия клеток данного организма в генетическом отношении они однородны, тождественны и тотипотентны.

Подводя итог рассмотрению современного состояния клеточной теории, нужно сказать, что именно клетка является единицей развития многоклеточных, единицей их строения, единицей функционирования и единицей патологических изменений организма.

Для того, чтобы понять не только значение структурных особенностей клетки, но и, главное, разобраться в функциональных отправлениях ее отдельных компонентов и всей клетки в целом, чтобы сочетать изучение морфологии клетки с главнейшими биохимическими и генетическими особенностями ее устройства и работы, чтобы изучать клетку именно с позиций современной клеточной биологии, необходимо хотя бы вкратце вспомнить основные молекулярно-биологические закономерности, еще раз кратко обратиться к содержанию центральной догмы молекулярной биологии (см. глава 3).

Глава 2. Методы клеточной биологии

Цитология возникла как ветвь микроанатомии, и поэтому одним из основных методов, который используют цитологи, - это метод световой микроскопии. В настоящее время этот метод нашел целый ряд дополнений и модификаций, что значительно расширило круг задач и вопросов, решаемых цитологией. Революционным моментом в развитии современной цитологии и биологии вообще было применение электронной микроскопии, открывшей необычайно широкие перспективы. С введением электронной микроскопии в ряде случаев уже трудно провести границу между собственно цитологией и биохимией, они объединяются на уровне макромолекулярного изучения объектов (например, микротрубочек, мембран, микрофиламентов и т.д.). Все же главным методическим приемом в цитологии остается визуальное наблюдение объекта. При этом исследователь не просто изучает и описывает морфологию объекта, он может видеть степень его сложности, локализовать отдельные детали, получить сведения о химизме той или иной части клетки, визуально и достаточно точно оценить ее метаболические свойства, выяснить строение этой части на макромолекулярном уровне. Это создает своеобразие цитологии как науки, использующей главным образом методы изучения клетки непосредственно глазом, вооруженным увеличивающими оптическими системами. Кроме того, в цитологии применяются многочисленные приемы препаративной и аналитической биохимии, методы биофизики.

Световая микроскопия

Световой микроскоп, главный прибор биологии, представляет собой оптическую систему, состоящую из конденсатора, объектива. Пучок света от источника освещения собирается в конденсаторе и направляется на объект (рис. 6). Пройдя через объект, лучи света попадают в систему линз объектива; они строят первичное изображение, которое увеличивается с помощью линз окуляра. Главная оптическая часть микроскопа, определяющая его основные возможности, - объектив. В современных микроскопах объективы сменные, что позволяет изучать клетки при разных увеличениях. Главной характеристикой микроскопа как оптической системы является разрешающая способность. Изображения, даваемые объективом, можно увеличить во много раз, применяя сильный окуляр или, например, путем проекции на экран (до 10⁵ раз). Вычислено, что разрешающая способность объектива, т.е. минимальное расстояние между двумя точками, которые видны раздельно, будет равно



d = 0,61 -----------

n sin 

где  - длина волны света, используемого для освещения объекта; n – коэффициент преломления среды;  - угол между оптической осью объектива и наиболее отклоняющимся лучом, попадающим в объектив. Разрешение микроскопа зависит от длины волны – чем она меньше, тем меньшего размера деталь мы можем увидеть, и от нумерической апертуры объектива (n sin ) – чем она выше, тем выше разрешение. Обычно в световых микроскопах используются источники освещения в видимой области спектра (400-700 нм), поэтому максимальное разрешение микроскопа в этом случае может быть не выше 200-350 нм (0,2-0,35 мкм). Если использовать ультрафиолетовый свет (260-280 нм), то можно повысить разрешение до 130-140 нм (0,13-0,14 мкм). Это будет пределом теоретического разрешения светового микроскопа, определяемого волновой природой света. Таким образом, все, что может дать световой микроскоп как вспомогательный прибор к нашему глазу, - это повысить разрешающую способность его примерно в 1000 раз (невооруженный глаз человека имеет разрешающую способность около 0,1 мм, что равно 100 мкм). Это и есть «полезное» увеличение микроскопа, выше которого мы будем только увеличивать контуры изображения, не открывая в нем новых деталей. Следовательно, при использовании видимой области света 0,2-0,3 мкм является конечным пределом разрешения светового микроскопа.

Но все же в световом микроскопе можно видеть частицы меньшей величины, чем 0,2 мкм. Это метод «темного поля», или, как его называли раньше, метод «ультрамикроскопии». Суть его в том, что подобно пылинкам в луче света (эффект Тиндаля) в клетке при боковом освещении светятся мельчайшие частицы (меньше 0,2 мкм), отраженный свет от которых попадает в объектив микроскопа. Этот метод успешно применяется при изучении живых клеток.

Если же необработанные живые или мертвые клетки рассматривать в проходящем свете, то в них различаются только крупные детали из-за того, что они обладают иным коэффициентом преломления и поглощения световых лучей, чем окружающая среда. Большая же часть клеточных компонентов мало отличается по этим свойствам как от среды (воды или тканевых растворов), так и друг от друга и поэтому мало заметны и не контрастны. Для их изучения приходится изменять освещенность (теряя при этом в четкости изображения) или применять особые методы и приборы. Один из таких приемов – метод фазово-контрастной микроскопии, широко использующийся для наблюдений за живыми клетками. Он основан на том, что отдельные участки прозрачной в общем клетки хоть мало, но все же отличаются друг от друга по плотности и по светопреломлению. Проходя через них, свет изменяет свою фазу, однако такое изменение фазы световой волны наш глаз не улавливает, так как он чувствителен только к изменению интенсивности света. Последняя зависит от величины амплитуды световой волны. В фазово-контрастном микроскопе в объектив вмонтирована специальная пластинка, проходя через которую луч света испытывает дополнительный сдвиг фазы колебаний. При построении изображения взаимодействуют уже лучи, находящиеся в одной фазе либо в противофазе, но обладающие разной амплитудой; тем самым создается светло-темное контрастное изображение объекта.

Сходный прием используется в интерференционном микроскопе. Он устроен так, что пучок параллельных световых лучей от осветителя разделяется на два потока. Один из них проходит через объект и приобретает изменения в фазе колебания, другой идет, минуя объект. В призмах объектива оба потока вновь соединяются и интерферируют между собой. В результате интерференции будет строиться изображение, на котором участки клетки, обладающие разной толщиной или разной плотностью, будут отличаться друг от друга по степени контрастности. В этом приборе, измеряя сдвиги фаз, можно определить концентрацию и массу сухого вещества в объекте.

С помощью поляризационного микроскопа изучают объекты, обладающие так называемой изотропией, т.е. упорядоченной ориентацией субмикроскопических частиц (например, волокна веретена деления, миофибриллы и др.). У такого микроскопа перед конденсором помещается поляризатор, который пропускает световые волны с определенной плоскостью поляризации. После препарата и объектива помещается анализатор, который может пропускать свет с этой же плоскостью поляризации. Поляризатор и анализатор – это призмы, сделанные из исландского шпата (призмы Николя). Если вторую призму (анализатор) повернуть затем на 90^о по отношению к первой, то свет проходить не будет. В том случае, когда между такими скрещенными призмами будет находиться объект, обладающий двойным лучепреломлением, т.е. способностью поляризовать свет, он будет виден как светящийся на темном поле. С помощью поляризационного микроскопа можно убедиться, например, в ориентированном расположении мицелл в клеточной стенке растений.

Витальное (прижизненное) изучение клеток

Световой микроскоп позволяет видеть живые клетки. Для кратковременного наблюдения клетки помещают просто в жидкую среду на предметное стекло; если нужно длительное наблюдение за клетками, то используются специальные камеры. Это или плоские флаконы с отверстиями, закрытыми тонкими стеклами, или же разборные плоские камеры. В качестве объектов можно использовать свободноживущие клетки простейших и других одноклеточных организмов, клетки крови или же разобщенные тканевые клетки многоклеточных организмов как животного, так и растительного происхождения. В любом из этих случаев клетки изучают в специально подобранных средах. Свободноживущие одноклеточные организмы рассматривают и изучают в тех же средах, в которых они живут в естественных условиях или культивируются в лаборатории. Так, для некоторых простейших созданы искусственные среды, на которых они растут и размножаются. Обычно это сбалансированные солевые растворы с добавками микроорганизмов или других простейших, служащих пищей для данного вида организма.

Клетки крови или другие свободные клетки многоклеточных могут изучаться в капле плазмы или в специальных синтетических средах.

Для изучения клеток органов и тканей животных используют метод клеточных культур. Более простой вариант этого метода заключается в том, что в камеру, наполненную питательной средой (смесь плазмы крови с эмбриональным экстрактом или смесь синтетической среды с добавлением плазмы крови), помещают небольшой кусочек живой ткани. Через некоторое время на периферии такого кусочка начинается деление и рост клеток. В другом случае вырезанный кусочек ткани слегка обрабатывают раствором фермента трипсина или хелатона - версена, что приводит к его диссоциации, к полному разобщению клеток друг от друга. Затем такую взвесь отмытых клеток помещают в сосуд с питательной средой, где они опускаются на дно, прикрепляются к стеклу и начинают размножаться, образуя сначала колонии, а затем сплошной клеточный пласт. Так растут однослойные клеточные культуры, очень удобные для прижизненных наблюдений. Лучше всего для получения первичных культур из тканей животных использовать эмбриональный материал; культуры из клеток взрослых организмов растут очень плохо.

При культивировании клеток вне организма кроме смены среды важно поддерживать и необходимую температуру (около 20^о для хладнокровных и около 37^о для теплокровных). Обязательным условием культивирования клеток является соблюдение стерильности. Существует целый ряд длительно культивируемых клеток; это специальные клеточные штаммы, приспособившиеся десятилетиями к росту вне организма. Большей частью это клетки опухолевого происхождения или значительно измененные клетки, приобретшие свойства опухолевых клеток.

Сейчас метод культивирования клеток вне организма широко используется не только для цитологических, но и для генетических, вирусологических и биохимических исследований.

В культуре можно выращивать и растительные клетки. Для этого кусочки ткани обрабатываются ферментами, растворяющими клеточные оболочки. Отделившиеся клеточные тела, протопласты, помещают в культуральную среду, где они делятся и образуют зоны размножившихся клеток.

Наблюдения за живыми клетками обычно регистрируются в виде фотографий, сделанных с помощью специальных фотонасадок к микроскопу. Живые клетки можно снимать и на кинопленку. В ряде случаев такая микрокиносъемка дает очень важную информацию. Применяя ускоренную или замедленную киносъемку (цейтраферная киносъемка), можно подробно видеть протекание таких важных процессов, как деление клеток, фагоцитоз, течение цитоплазмы, биение ресничек и т.д.

Теперь с развитием компьютерных технологий с помощью специальных телекамер возможно получать изображение клеток прямо на мониторе компьютера, записывать их в памяти компьютера, всячески обрабатывать и получать отпечатки на принтерах цветных или черно-белых. Так же возможно использовать такую компьютерную видеотехнику для цейтраферной съемки подвижных объектов .

При исследовании живых клеток используют методы микрохирургии, оперативного воздействия на клетки. С помощью прибора микроманипулятора клетки разрезают, извлекают из них части, вводят вещества (микроинъекция) и т.д. Микроманипулятор совмещается с обычным микроскопом, в который наблюдают за ходом операции. Микрохирургическими инструментами служат стеклянные крючки, иглы, капилляры, которые имеют микроскопические размеры и изготовляются на специальных приспособлениях – «микрокузницах». При микроманипуляциях клетки помещают в специальные камеры, в которые вводят также инструменты. Так, с помощью микроманипулятора удалось пересадить ядра от одного штамма амебы другому и доказать, что именно клеточное ядро определяет физиологические особенности клетки в целом. С помощью микроманипулятора удалось инъецировать в клетку амебы коллоидное золото, а затем исследовать распределение его частиц в цитоплазме и ядре.

С помощью таких микрохирургических инструментов можно поворачивать в клетках митотические веретена, оттаскивать отдельные хромосомы, вводить в живую клетку меченые антитела или разные белковые молекулы. Кроме механического воздействия на клетки в микрохирургии в последнее время широко применяют микропучки ультрафиолетового света или лазерные микропучки. Это дает возможность практически моментально инактивировать отдельные участки живой клетки. Так, например, можно инактивировать одно из ядрышек и следить за судьбой второго, интактного. В этом случае показано, что второе ядрышко принимает на себя дополнительную нагрузку и «работает за двоих». С помощью микропучков удается поразить часть митотической хромосомы или участок веретена деления. Оказалось, что поражение центромеры хромосомы выводит последнюю из процесса расхождения хромосом к полюсам клетки во время митоза. Недавно стали применять аппараты с лазерным микролучом, что позволяет очень точно дозировать количество энергии в точке поражения и использовать очень короткие (наносекунды) импульсы облучения.

При изучении живых клеток пытаются их окрашивать с помощью так называемых витальных красителей. Это красители кислой (трипановый синий, литиевый кармин) природы, применяемые при очень большом разведении (1 : 200000), следовательно, влияние красителя на жизнедеятельность клетки минимальное. При окрашивании живых клеток краситель собирается в цитоплазме в виде гранул, а в поврежденных или мертвых клетках происходит диффузное окрашивание цитоплазмы и ядра.

При изучении живых клеток широко используют флуоресцирующие красители и метод флуоресцентной микроскопии. Суть его заключается в том, что целый ряд веществ обладает способностью светиться (флуоресцировать, люминесцировать) при поглощении ими световой энергии. Спектр флуоресценции всегда смещен в сторону больших длин волн по отношению к возбуждающему флуоресценцию излучению. Так, например, выделенный хлорофилл при освещении в ультрафиолетовых лучах светится красным цветом. Этот принцип используется в флуоресцентной микроскопии: рассматривание флуоресцирующих объектов в зоне коротких длин волн. Обычно в таких микроскопах применяются фильтры, дающие освещение в сине-фиолетовой области. Существуют ультрафиолетовые люминесцентные микроскопы.

Характеристики

Список файлов книги