Дж. Уилсон, Т. Хант - Молекулярная биология клетки - Сборник задач (1120987), страница 77
Текст из файла (страница 77)
Повторите расчет для гетерозиготы по точковой мутации а!(1)-гена. Рассчитайте долю молекул коллагена типа П1, 1а! (П1))э, которая будет нормальной для индивида, гетерозиготного по делеции всего а1(1П)-гена. Повторите расчет для гетерозиготы до точковой мутации а1(1П)-гена. Дефект какого типа в гене коллагена, делеция или точковая мутация, с болыпей вероятностью является доминантным (т.е. приводит к проявлению мутантного фенотипа у 1етерозиготы)? 14-12 В 14-13 Формирование зрелой молекулы коллагена — это сложный процесс.
Сначала из трех коллагеновых цепей, имеющих дополнительные участки на Ы- и С-концах, образуется проколлаз ен. Если Таблииа 14-2. Действие ксилозидов на синтез гликозаминогликоиоо (включение мВОч клетками культивируемой слюнной жслсэы] (задача (4-1() цузстзитепьные к протеазе структуры Устойчивые к протеазе стоу птуры Коллаген типа ) П с ае с Меыцзпочзчная В-з.слизь неп ь Глоеулпрный головной конец Рпс. 14-10.
Нативная я денатури- рованная формы коллатена типа П! н рХ-коллагела типа 1П (задача )4- ! 3). 052) х й л а к Рве. 14-11. Анализ повторной сборки коллагела типа РП я рв)- коллагеяа типа П! (задача 14-13). После разных по длительности пернолов инкубацля при 25'С образцы обрабатывали трвпсвном, а затем подвергали злектрофорезу. Затемненные области соответствуют положениям устойчивых к тряпсину пептидов. Числа в скобках показывают примерное число амлнокнслотяых остатков в составе устойчивых к трнпсину пептидов. Клеточная адгезыя, контакты, матрице 289 цепи правильно переплетутся друг с другом, концевые пептиды отщепляются.
Основная функция концевых пропептидов, по-видимому, заключается в правильном расположении цепей для облегчения их сборки. Процесс сборки коллагена изучали с использованием двух форм колла!сна типа П1: зрелого коллагена типа П1 и его предшественника с еще сохраняющимися (ц)-концевыми пропептидами — РХ-коллагена типа П1 (рис. 14-!О). В обеих формах коллагена индивидуальные цепи удерживались вместе дисульфидными связями. Эти связи удерживают цепи в определенном порядке, так что если даже последние полностью расплетутся, то молекулы коллагена вновь соберутся правильно (рис.
14-10). Повторную сборку таких двух форм коллагена изучали после их денатурации при 45'С в условиях, при которых дисульфидные связи оставались интактными. Затем температуру снижали до 25'С, создавая условия для восстановления коллагенов, и периодически отбирали пробы в течение 60 мин. Каждую пробу сразу же обрабатывали трипсином, который быстро расщепляет денатурированные цепи, но не затрагивает цепи в спиральной молекуле коллагена.
Затем пробы исследовали с помощью двумерного электрофореза в присутствии 2-меркаптоэтанола, который разрушает дисульфидные связи. Оба коллагена дали одинаковые полосы в геле (рис. 14-11). Обращает на себя внимание то, Время экспозиции при 25' С. ыин Маркел натизного С 5 тс 2О зо еа 55 55 коплагена 270 Глава 14 что, если дисульфидные связи оставались интактными во время электрофореза, все полосы сменялись полосами с трехкратно увеличенной мол.
массой. А. Почему все устойчивые к трипснну пептиды увеличиваются в трн раза по мол. массе, если дисульфидные связи остаются интакт- ными? Б. Какие дисульфндные связи в р?ч-коллагене типа 111 (Х-концевые или С-концевые) ответственны за увеличение мол. массы этих устойчивых пептидов? В.
Как начинается сборка таких коллагеновых молекул: по специфи ческим или по случайным участкам? Если по специфическим, то укажите эти участки. Г. Происходит ли сборка с помощью механизма типа застеж- ки-молнии или в ее основе лежит принцип «все или ничего»? Как это определить на основе приведенных результатов? Фибронектин-это крупный гликопротеиновый компонент внеклеточного матрикса. В его молекуле имеется несколько связывающих доменов, расположенных вдоль полипептидной цепи; один из них служит для присоединения к рецепторам фибронектина на клеточной поверхности. Фибронектин способен прикреплять клетки к поверхностям, на которых другим способом они не могли бы закрепиться.
На этом основан простой способ изучения той части его молекулы, которую узнает рецептор фибронектина. Фибронектин наносят на поверхность пластиковых чашек. Затем в них помещают суспензню клеток и проводят инкубацию в течение 30 мин, после чего чашки отмывают и подсчитывают число прикрепившихся клеток. В отсутствие фнбронектина клетки не прикрепляются, а в его присутствии прикрепляется 80-90',э клеток.
Другие белки, например сывороточный альбумин, прикрепляются к пластику, но не способствуют прикреплению клеток. С помощью такого метода можно анализировать очень мелкие фрагменты фибронектина при условии, что они химически соединены с крупными молекулами, например с альбумином, обеспечивающими прикрепление к пластиковым чашкам.
Получая фрагменты фибронектина, можно идентифицировать домен, связывающнйся с клеткой, например сегмент из 108 амннокислотных остатков, составляющий три четверти длины всей цепи от о1-конца. Для точной локализации активного участка с помощью метода связывания клеток были проверены синтетические пептиды, соответствующие различным участкам сегмента нз 108 аминокислотных остатков. Были поставлены эксперименты двух типов. В одних пептиды ковалентно связывались через цистеиновый остаток с белком, покрывающим пластик, после чего их проверяли на способность вызывать прикрепление клеток. Полученные результаты представлены в табл. 14-3.
В других опытах пластиковые чашки покрывали нативным фибронектином и клетки инкубировали в чашках в течение 30 мин в ирису~стени синтетических пептидов, указанных в табл. 14-4. Затем чашки отмывали и подсчитывали число прикрепившихся клеток. 14-14 к определению присоеднняющегося к клеткам фрагмента фибро- нектина. Одинаковы ли способы прикрепления клеток к чашке в двух вариантах опытов? Объясните разницу между вариан- тами.
А. В экспериментах двух типов использованы разные подходы Таблица 14-3. Тестирование фнбронектнн-подобных пептидов на способность вызывать прикрепление клеток (задача 14-14) Коицентрацвя, необходимая лля р ре е я 50»;, клеток, кмоль)мл Последовательность Певтвд ТАутакаояРАяякР!янукте)ОКРя)м(с) * утОкаояРАЗЗКР)(с) ягнуктшокряам(с) утакООЗРА(с) ЯРАЯЯКР)Я(С) утакао(с) аксая(с) каоярд(с) РЧОЯРА(С) з (С) ав С-ковцв уввзыввет ив связь с белком-носителем через ластеил. Таблица 14-4.
Тестирование фнбро- нектнн-подобных пептидов на спо- собность блокировать прикрепле- ние клеток (задача 14-14) Б. По результатам, приведенным в таблицах, определите, какая аминокислотная последовательность фибронектина узнается клетками. В. Как можно использовать эти результаты для создания метода выделения рецептора фибронектинач Процент пракреивв- щвхся клеток Пептад 14-1Б Один из способов получения мутаций у мышей состоит в том, что зародышей инфицируют ретровирусами, которые встраиваются в геном случайным образом.
Если ретровирус включается в клетку, которая станет частью зародышевой линии, то он сохраняется в последующих поколениях. Используя этот метод, вы получили чрезвычайно интересную линию, в ко~арой ретровирус, по-видимому, встроился в ген, имеющий решающее значение для раннего эмбрионального развития (рис. 14-12,А). Важная роль этого гена выявляется в опытах по скрещиванию брат х сестра между гетерозиготами по ретровирусной вставке с последующим анализом ДНК от 12-дневных зародышей. Используя зонд, расположенный непосредственно около сайта встраивания, вы обнаруживаете три явно различающихся набора фрагментов гибридизации (рис. 14-12, Б): набор 1 характерен для гомозигот 2,0 1,9 48 49 47 ОКОПБРС ОКОПАРС ОКОПБРС ОКА1)БРС ОКОЕБРС Отсутствует Е.
АНАЛИЗ В ГЕЛЕ д, структура Генов Нарыввьный Мутантные зародыш звредыши ) 2 3 Зонд ЮЖвзй ««««««« н Дикий тин ~«« Звнд «««««М«« и Мутант 2«««««« н Рвтрввируе Рве. 14-12. Анализ ДНК зароды- шей, полученных от скрещивания ибрат х сестра» (задача 14-15). л. Соотношение между нормаль- ным геном и геном с ретровирусной вставкой. Б. Радноавтограф, полу- ченный после расщепления ДНК рестриктазой (К), которая не дей- ствует на ретровирус, н после- дующего разделения фрагментов в геле. ДНК переноснлн на ннтро- целлюлозный фильтр, гнбридизова- ли с радиоактивным зондом, кото- рый соответствовал клеточным последовательностям, расположен- ным непосредственно вблизи сайта встраивания, и подвергали радио- автографии.
Фибронектнн Пептид 1 Пептид 2 Пептнд 3 Пептид 4 Пептнд 5 Пептнд б Пептид 7 Пептнд 8 Пептнд 9 Клеточная адгезия, контакты, матрикс 271 0,10 0,25 !,б > 100 2,5 > !00 1О 3,0 6,0 > 100 272 Глава 14 И«еле«у«ма~к ген по нормальному гену, набор 2 — для гетерозигот, а набор 3 — для гомозигот по мутантному гену. Набор 3 выявляется примерно у четвертой части 12-дневных зародышей, но вы никогда не находите его у новорожденных.
Выясняется также, что примерно на 14-й день такие зародыши погибают, по-вицимому, из-за обильного кровотечения из крупных кровеносных сосудов. Во всех остальных отношениях основные ткани и типы клеток кажутся нормальными. Из этого следует, что у гомозигот мутантный ген вызывает нарушение на определенной стадии развития. При последующей работе вы обнаруживаете, что мРНК, соответствующая поврежденному гену, вырабатывается только фибробластами, миобластами и хондроцитами.
Кроме того, вы устанавливаете, что эта мРНК появляется в заметных количествах на !2-й день и затем ее уровень существенно повышается по мере развития. Все эти факты-уровень экспрессии, типы участвующих в этом клеток и разрыв кровеносных сосудов — заставляют вас заподозрить, что дефектный ген кодирует коллаген или какой-то другой компонент внеклеточного матрикса. В соответствии с этим вы берете у других исследователей несколько клонов гена коллагена и используете их для анализа мРНК от 12-дневных нормальных и гомозиготных м)тантвых зародышей (см.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
