Дж. Уилсон, Т. Хант - Молекулярная биология клетки - Сборник задач (1120987), страница 140
Текст из файла (страница 140)
Прикрепление клеток к чашкам в двух вариантах опытов означа- 496 Глава 14 ким пептидом, т.е. присоединение пептида к клетке исключает возможность ее связывания с поверхностью чашки. Эти два типа экспериментов представляют собой альтернативные пути для выяснения одного и того же, а именно механизма специфического взаимодействия между рецептором, находящимся на клеточной поверхности, и лигандом, присутствующим в окружающей клетку среде. Б. В первом варианте опытов активность проявляют только те сегменты, которые содержат трипептид КОП (аргинин — глицннаспарагиновая кислота). Данные для пептица 9 показывают, что даже очень малые изменения в этой короткой последовательности исключают возможность связывания: замена компактной молекулы глицина (О) на крупную молекулу валина (Ч) приводит к ннактивации пептида. Результаты второго варианта опытов согласуются с результатами первого варианта и доказывают, что последовательность КОО совершенно необходима для активности.
Даже консервативные замены аргинина (К) на лизин (К.) (одна основная аминокислота на другую) и аспарагиновой кислоты (13) на глутаминовую (Е) (одна кислая аминокислота на другую) исключают связывание пептида с клеткой. В. Специфичность связывания малых пептидов открывает возможность использования аффинной хроматографии для выделения рецептора фибронектина, и эта стратегия была успешно применена.
Сначала пептид, содержащий связывающую рецеп~ор последовательность КО)3, сорбировали на матриксе колонки, в данном случае на сефарозе. Затем через колонки пропускали растворенные детергентами белки плазматической мембраны, соблюдая условия, способствующие взаимодействию между рецептором н фибронектином. Далее колонку тщательно промывали для удаления несвязанных белков. Наконец, рецептор снимали с колонки, добавляя к отмывающему буферу пептид ОКОГЗЗР.
При этом элюировался единственный белок с мол. массой 140 кДа. (Если использовали ОКОЕЯР, этого не происходило.) Латератураг РмгтгЬЬигЬег, М.ГЭ.! Еиш!аьгг, Е. Сеп аиас1ппел! ас!ГЫу оГ ПЬгопесиа сал Ье Иарйса!ед Ьу зглай зупгйеИс Ггаялгел!з оГ !Ье гло1еса1е. ЬГа!аге 309, 30 -33, 1984. Руге!а, Яс РгегзгЬЬагяег, М.Р.: киот(ааг1, Е. ЫелИПсаИсл алд йо!аИоп оГ а 140 Ггд сей заг(асс 81усоргоге!л чч!!Ь ргорепез езресгеИ оГ а ЙЬголесИл гссер1ог. Сей 40, 191 "198, !985. Яиодиьг!, Е. РгегзгЬЬагаег, М.Г1. Агя-О!у-Азр: а чегза01е сеП гесояьПИоп Ияпа1.
Сей 44, 517 — 518, 1986. 14-15 А. При анализе гена коллагена а1(1) исследуемого гена получаются идентичные наборы фрагментов мРНК, следовательно, весьма вероятно, что исследуемый ген является геном коллагена а1(1). Разумеется, хотелось бы убедиться в этом, показав, что тестируемый зонд гибридизуется непосредственно с зондом а1(1). Результат идентификации поврежденного гена несколько удивителен, поскольку коллаген типа 1, компонентом которого является продукт данного гена, обнаруживается главным образом в коже, сухожилиях, костях, связках и внутренних органах. Основным коллагеном в кровеносных сосудах является коллаген типа П1 (см.
МБК, табл. 14-3). По-видимому, коллаген типа 1 важен для поддержания целостности кровеносных сосудов, по крайней мере на ранней стадии развития. Клеточная адгезия, контакты, матрикс 497 Б. В. Межклеточное узнавание и адгезия 14-16 А. Б. Г. Д Е. Ж. слизевики, или миксомнцеты хемотаксис лискоидин-1 контактный сайт В; контактный сайт А гомофильное; гетерофильное Х-САМ; 1.-САМ Е-кадгерин 14-17 А. Б. Неправильно, Утверждение, вероятно, правильно по духу, но оно ошибочно в деталях.
Уоррен Льюис, который был пионером клеточной биологии, пытался привлечь внимание к важности адгезивных свойств клеток в тканях в то время, когда эту проблему полностью игнорировали современные ему биологи. Большую часть нашего тела составляет соединительная ткань, целостность которой зависит от качества матрикса, а не от заключенных в нем клеток (не так-то легко разъединить клетки ткани, что может подтвердить каждый, кто ел жесткий бифштекс). Правильно.
Скрещивание между гетерозиготамн приведет к простому менделевскому расшеплению. До проявления летального эффекта 25'/е зародышей будут гомозиготны по неповрежденному гену (набор 1), 25еге — гомозиготны по поврежденному гену (набор 3) и 5088 — гетерозиготны (набор 2). Поскольку набор 3 не проявляется у живых новорожденных, то одна треть из ннх будут гомозиготны по неповрежденному гену (набор 1), а две трети— гетерози! отцы (набор 2). Клонирование неповрежденного гена, соответствующего гену с ретровнрусной вставкой,— это прямой н очень плодотворный подход.
Ниже приводится основная методика. 1. Приготовить библиотеку геномной ДНК мыши, несущей ретровирусную вставку. Использовать рестриктазу, разрезаюшую ДНК вне ретровнрусных последовательностей. 2, Используя в качестве зонда ДНК ретровируса, провести скрининг библиотеки для обнаружения клонов, содержащих ретровирусные последовательности. 3. Субклонировать сегмент клеточной ДНК, фланкирующий (окаймляющий) ретровирусные последовательности. (Существенно, чтобы эта ДНК не содержала повторяющихся последовательностей.) Эта фланкирующая ДНК содержит интересующий ген. 4. Субклонированную клеточную ДНК использовать для скрининга библиотеки геномной ДНК (и/или библиотеки кДНК), полученной от нормальных мышей.
Эти клоны содержат в неизмененном виде интересующий ген. Латератураг эаеяпгб, Яс Нагбегк К.; 5гЬиеГге, Ас Г-оыег, уе С)гитаГгои Г; 3еГгяег, Гэ„бгогГгорр, ГГ.; НоЯтаял, Е. Сгепи!1яе гпгекгабоп оГ Мс!опеу пшпле 1еи(геш1а т(пге а! Гйе Мог !3 1осиа 1еаг)а гс геееаз(те !егЬа1 липабои алгГ еаг!у ешЬгуошс пеапь Се!1 32, 209-210, 1983. Яг)гаге!ге, Ас Нлгбегк Кс эаеяига, Я. ЕятЬгуошс 1е1Ьа! тигаисл ш пасе Гпписед Ьу ге!тот)гие Гиеегйоп !л!а !Ье и!(1) со1!акеп зеле.
ГЧа!иге 304, 315-320, 1983. 498 Глава 14 В. Неправильно. В норме разви~ие тканей не связано с сортировкой смешанных случайным образом клеток разных типов. Г. Правильно. Д. Неправильно. Антитела к большинству компонентов клеточной поверхности не подавляют адгезию клеток. Насколько это из- вестно, только антитела к гликопротеинам клеточной поверх- ности, участвующим в процессе адгезии, действительно ингиби- руют адгезию. Е. Правильно. То, что плотно сцепленные клетки связаны более слабыми взаимодействиями, чем те, за счет которых образуется относительно недолговечный комплекс гормона с рецептором, несколько противоречит интуитивному представлению. Прочность межклеточного связывания основана на многочисленных слабых взаимодействиях, суммарный эффект которых очень силен.
Ж. Правильно. 3. Правильно. Результаты, представленные на рис. 14-14, свидетельствуют в пользу химической сигнализации. На это указывают, в частности, ограниченная сфера действия сигнала (опыты А и Б), его способность обогнуть край стекла (опыт Б) и проникать через полупроницаемую мембрану, но не через стекло (опыты А и В), выраженное влияние слабого потока жидкости (опыт Г). Эти опыты почти полностью убеждают в химической природе сигнализации, однако решающим доказательством должно быть выделение сигнального соединения. 14-18 Литература: оопаег, д Тс Западе, Б Е Егьйепее !ог Гйе Гоппабоп оу ее!! аяягеяаееа Ьу еЬегоогах!х 1п гЬе Йеие!ортов» о! гЬе а!ппе гоо!д пкгуолгеяит Апеойеит. Ь Ехр.
2оо!. !06, ! — 26, !947. крайней мере одним хвостовым волокном в любой данный момент времени, равна единице минус доля фагов, не прикрепленных ни одним хвостовым волокном. Последняя равна (0,5)гх = 0,00024 для бактерий дикого типа и (0,5)" = 0,0!6 для отрС -бактерий, т.е. в каждый момент времени 99,98'й фатов популяции будет прикреплено к бактериям дикого типа и 98,4те— к отрС -бактериям.
Б. Очень малая разница в относительных количествах фагов, при крепленных к бактериям дикого типа и к отрС -бактериям, на первый взгляд слабо согласуется с тысячекратной разницей в инфекционности. Однако поскольку фагу Т4 нужно передвигаться по поверхности бактерии, чтобы найти подходящее место для прикрепления своей баэальной пластинки, то расчет для одного короткого момента времени приводит к ошибочным выводам.
Например, если Т4 должен быть связан с поверхностью бактерии во время своего блуждания в течение 500 «моментов», то прикрепленными к бактериям дикого типа останутся (0,9998)~~~ = 90те, а к отрС -бактериям-только (0,984)~~~ = = 0,03'/е. Этого различия более чем достаточно для 1000-кратной разницы в инфекцнонности. Благодаря связыванию с бактериальной поверхностью за счет многочисленных слабых взаимодействий фаг Т4 может перемешаться по клетке, не открепляясь от нее. Это позволяет ему искать относительно редкие на поверхности места, пригодные 14-19 А. Доля в популяции тех фатов, которые будут прикреплены по Клеточная адгезия, контакты,матрикс 4ЭЭ для инъекции ДНК, †точ соединения между внутренней н наружной мембранами. По той же причине, вероятно, важны многочисленные слабые адгезионные взаимодействия между клетками: они позволяют клетке искать соседей, не прикрепляясь раньше времени. Литература: Оо14Ьетй Е.
Весоягйбоп, ацаеЬгпепд 1п)ес11оп. !и Васгепорйаде Т4 (С.К. Ма1Ьевз; Е.М. Копет; О. Моыд; Р.В. Вегяег, едз.), рр. 32 39. 'йгавЬ1пя1оп, О,Сл Агпепсап Вос(егу (ог М)сгоЬго1оду, 1983. 14-20 А. Проведенные наблюдения показывают, что в агрегацин тромбо цитов участвуют два различных рецептора поверхности (адгезионные молекулы), которые связываются через молекулу фибриногена, служащую соединяющей молекулой-мостиком. Это механизм, показанный на рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
