Дж. Уилсон, Т. Хант - Молекулярная биология клетки - Сборник задач (1120987), страница 131
Текст из файла (страница 131)
Способность субъединицы О открывать К+-кару нал в отсутствие ацетилхолина и ОТР дает основание считать, что она и есть активная часть О-белка в этом процессе. Это 462 Глава 12 довольно неожиданный вывод, т.к. за стимуляцию аденилатциклазы в других клетках ответственна О„-субъединица. Как обычно бывает, когда какие-то новые данные ставят под сомнение общепринятые научные представления, эти результаты вызвали оживленные споры, которые не утихают до сих пор (см.
литературу). Возможно, на результаты повлияли некие незначительные артефакты, возникшие из-за недостатков в способе постановки эксперимента, поэтому они нс вполне адекватно отражают регуляцию К'-каналов в сердце, В конце концов вопрос решится в ходе дальнейших экспериментов, и эти выводы будут приняты или отвергнуты. В любом случае наше понимание механизмов клеточной сигнализации только выиграет. В. Эти эксперименты практически исключают вероятность участия внутриклеточного посредника в активации К+-канала. Поскольку буфер не содержит АТР или Са'+, ни один из этих потенциальных медиаторов не может быть вовлечен в открывание К~-каналов. То же самое можно сказать о диацилглицероле и 1пзРа, по краиней мере имея в виду обычные механизмы их действия.
Хотя оба этих вещества и могли бы образоваться, однако ни одно из них не может действовать обычным путем. 1ссаРэ в норме влияет на концентрацисо Саян (чего здесь он делать не может), а диацилглицерол активирует протеинкинаэу С (для действия которой необходим АТР). Простейшая интерпретация этих данных состоит в том, что активация К'-каналов ОГС7-субъединицей происходит напрямую, хотя нельзя исключить и участия в активации некоторых других компонентов мембраны. Г.
Упрощенная схема активации К+-канала ацетилхолином с участием О-белка показана на рис. 12-21. Литературас Г,ода!!се!!к ГС. ЕС Кигасас Ус баГрег, Ус Меег, Е.У.; С!а!с!сит, 0.Е. ТЬе (17 епоцшса оГ ОТР-Ьпсгйпя ргогеша асесеаСе СЬе пшасаппсс К+ сЬаапе! сп Ьеатс. в!а!псе 325, 321-326, 1987. Вйлбаитег, Г,.! Вгоггп, А.М. О ргопйп ореп1пЯ оГ К' сЬаппе1а. Гйаспге 327, 21, 19Я7.
йово!!се!!а, Гг. Ес КигаеЫ, К; ба!рег, ри ГЧеег, Е уэ СГараат, 77.Е. О ргосеш орешпя оГ К' сЬаппе!а. !наготе 327, 22, 19В7. Ане лиани аол -канал аол Аиатилколин Рис. 12-21. Схема, иллюстрируюшая активацию ацетиихолииом К+-каиалов а сердце (ответ 12-17). атл Межклаточная сигнализация 463 Механизмы действия циклического АМР и ионов кальция 12-19 А. Б.
В. Г. сАМР-зависимая протеинкиназа (А-киназа) кальмодулин кальмодулин-зависимые протеинкиназы (Са-киназы) гуанилатциклаза 12-20 А. Неправильно. Повышенное содержание сАМР в мышечных клетках способствует расщеплению гликогена н подавлению его синтеза. Правильно. Правильно. Неправильно. Ферменты, удаляющие фосфатные группы из белков, называются фосфатазами. Фосфорилазы разрывают связи, присоединяя фосфаг (аналогично гидролазам, которые разрывают связи, присоединяя воду).
Правильно. Правильно. Правильно. Неправильно. Во всех клетках содержатся протеинфосфатазы, которые в конце концов выключат эту киназу. Б. В. Г. д Е. Ж. 3. 12-21 А. Если бы А-киназа была в клетках хомячка необходимым ферментом, то невозможно было бы получить мутанты, лишенные активности А-киназы,— онн были бы нежизнеспособны. Следо- 12-18 А. Результаты, изложенные в пунктах 1, 2 и 3, могут получаться при обоих предполагаемых способах высвобождения арахидоновой кислоты, но наблюдения 4 и 5 позволяют разграничить их. Если источник арахидоновой кислоты — расщепление диацилглицерола, образующегося одновременно с инозитолфосфатом, то в обоих экспериментах образование арахидоновой кислоты должно идти параллельно накоплению последнего, в частности оно должно подавляться при обработке ингибитором фосфолипазы С (когда образование диацилглицерола прекращается) и быть нечувствительным к коклюшному токсину (которьгй, по-видимому, не влияет на выход диацилглицерола).
Б. Наблюдения ! и 2 свидетельствуют о том, что на освобождение арахидоновой кислоты влияют а,-адренергические рецепторы. Стимуляция выброса арахидоновой кислоты с помощью ОТР-7-Я указывает на участие в этом процессе О-белка; подавление образования арахидоновой кислоты коклюшным токсином подтверждает это. Однако токсин-чувствительный О-белок, по-видимому, нетождествен тому белку, который активирует фосфолипазу С, поскольку на ее активацию коклюшный токсин не влияет. В то же время эти эксперименты не проясняют связи между О-белком и фосфолнпазой А,. Латератураг Вигсь, КМ.; Бгдпг, Ас Акг1год, г'.
Рьоерпойраае А, апд рйоарйойраее С аге асйтагед Ьу гйаггпсг ОТР-Гппд1п8 ргоге!пз гп геаропге 1о а,-адгепег81с г11гпп1а11оп гп РИТА 1Ьуго1д сейа, Ргос. Ха11. Асад. Всй г18А 83, 7201 — 7205, 1986, 464 Глава 12 вательно, в этих клетках А-киназа незаменимым ферментом не является (точно так же, как и в ряде других клеточных линий, для которых были получены аналогичные мутанты). Однако из этого не следует, что без А-киназы может обой~ись и целый организм.
Существует множество примеров того, как дефект фермента, имеющий минимальные последствия для клеток в культуре, оказывался весьма тяжелым для целого организма. Б. Мутации, приводящие к элиминации каталитической субъединицы, делают клетки нечувствительными к высоким концентрациям сАМР, и, следовательно, резистентными к сАМР. Эти мутации рецессивные, поскольку в присутствии каталитической субъединицы дикого типа чувствительность к сАМР у них восстанавливается. (Может казаться, что мутации„элиминирующие регуляторные субъединицы, будут приводить к таким же эффектам.
Однако в отсутствие регуляторных субъединиц А-киназа будет активна постоянно, что приведет к летальным последствиям: избыток А-киназной активности является причиной гибели клеток при высоких концентрациях сАМР. Таким образом, клеточные линии без регуляторных субъединиц просто нельзя было получить.) Несколько труднее объяснить доминантные мутации. В общем доминантность указывает на измененную активность, а не на полную ее потерю. Доминантные мутации были обнаружены и в регуляторных, и в каталитических субъединицах.
Возможная доминантная мутация в регуляторной субъединице — это та, которая увеличивает сродство к каталитической субъединице. Такой мутант может реагировать только на повышенный уровень сАМР (необходимый для вытеснения прочно связанной регуляторной субъединицы). Доминантность мутации будет обусловлена тем, что мутантные регуляторные субъединицы, связываясь с каталитическими при низких концентрациях сАМР, вытесняют нормальные регуляторные субъединицы.
Еще труднее объяснить доминантные мутации в каталитической субъединице. Возможно, мутантные каталитические субъединицы связываются с регуляторными более прочно, изменяя чувствительность киназы как целого к сАМР. Такая мутация будет выявляться как доминантная в том случае, если при соединении мутантной каталитической субъединицы с нормальной каталитической субъединицей образуется гетеродимер, который связывается с регуляторной субъединицей так же, как мутантный.
При этом смесь из равных количеств мутантных и нормальных каталитических субъединиц будет проявлять А-киназную активность на уровне 1!4 от нормальной А-киназной активности (только 1/4 часть каталитических димеров будет состоять из двух каталитических субъединиц дикого типа). В. Приведенные результаты в целом подтверждают мнение (пока еще спорное), что все эффекты сАМР реализуются с участием А-киназы, но для доказательства этой гипотезы данных недостаточно. В сходных работах, где использовались другие линии клеток, также были выделены мутанты по А-киназе. В клетках, полностью лишенных А-киназы„не наблюдается ни один из обычных эффектов сАМР.
Таким образом, на сегодня нет данных, которые доказывали бы, что в эукариотических клетках существует какая-то мишень для действия сАМР, отличная от А-киназы. Меж«легочная сигнализация 466 Литературж бег!езжая, М.м. С«лебен о! сус((с-АМР-4(ерепг(е»Г ргогега (В»анен. 1л М«1«си!аг Се1! Оспе!(сн (М. М. Ооценлнал, ег).), рр. 711 — 743.
Хеи Уог(г: йг(1еу, 1985. 12-22 А. Разница в поведении киназы легких цепей миозина, выделенной в присутствии н в отсутствие ингибиторов протеаз, позволяет думать, что регуляторный домен киназы чувствителен к расщеплению протеазами клеточного экстракта. Поскольку именно регуляторный домен должен взаимодействовать с кальмодулином, то неудивительно, что лишенная регуляторного домена киназа на колонке с кальмодулином не задерживается. В свою очередь, активация киназы вследствие протеолитнческого удаления (или разрушения) регуляторного домена дает основание заподозрить, что этот домен каким-то образом «закрывает» активный центр.
При связывании комплекса Саг -кальмодулин эта регуляторная «заслонка» открывается и киназа начинает работать. Такие регуляторные заслонки, прикрывающие активный участок, распространены, по-видимому, достаточно широко. Ионы Сан'„проникнув в цнтоплазму, связываются с кальмодулином и вызывают изменение его конформации. Комплекс Са ' — кальмодулин связывается с регуляторным участком киназы легких цепей миозина, «освобождая» ее активный центр. Активнрованная киназа фосфорилнрует легкие цепи миозина, которые при этом тоже меняют свою конформацию; теперь они могут взаимодействовать с актином и инициировать таким образом сокращение. Можно предположить, что оканчивается сокращение благодаря работе фосфатаз, удалжощих с легких цепей мнозина фосфатные группы.
Аффннная хроматография на колонке с кальмодулином в качестве первой стадии очистки киназы легких цепей миознна вряд ли будет эффективной — в клетках очень много кальмодулина, обычно около 1% от общего белка клетки. В присутствии Са" киназа будет связана с комплексом Сан4 — кальмодулнн, присутствующим в клеточном экстракте, и эффективного связывания с кальмодулином иа колонке не получится.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
