О.О. Фаворова - Лечение генами - фантастика или реальность (статья) (1117902), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Внесение ДНК в комплексе слипосомами – искусственными мембранными пузырьками, приготовленными из липидов, которыесливаются с плазматической мембраной клетки, –обеспечивает достаточно эффективный перенос внее ДНК. Предлагается также использовать комплексы ДНК с белками, для которых на поверхности клетки имеются специфические рецепторы. После связывания рецептором белка чужеродная ДНКвместе с белком будет поглощена клеткой-мишенью. Наконец, еще один подход использует природную способность вирусов проникать в клетки ипривносить в них собственный генетический материал.
В последнее время на основе генетическогоматериала вирусов создано множество генноинженерных конструкций, служащих векторами, то естьсредствами доставки новых генов в клетки. Используют ретровирусные (их особенности будут пояснены позже) и аденовирусные векторы, а также векторы на основе некоторых других вирусов.Главное в методе переноса генов – включается(интегрирует) ли новый ген в хромосому клеткимишени.
Для активно делящихся клеток отсутствиеинтеграции внесенного гена в клеточную ДНК означает его неминуемую утрату в клетках-потомках(рис. 1). Одной из основных причин того, что в 80%случаев для внесения чужеродной ДНК при клинических испытаниях на людях использовали ретровирусные векторы, является его стабильная интеграция в клеточный геном. Кроме того, эти векторыобеспечивают высокую эффективность доставкиИнтеграцияХромосомнаяДНКТаблица 1. Методы внесения ДНК в эукариотическиеклетки и область их примененияПривнесенныйгенПрименимостьдля доставки геновМетоды переноса ДНКЯдро клеткив культивив тканируемые клеткиХимическиеосаждение ДНК фосфатом CaИнтеграции нет+–+++–––+++++++++–Деление клеткиФизическиеэлектропорациямикроинъекциябомбардировка частицамипростая инъекцияСлияниелипосомыОпосредованное рецепторамипоглощениеДНК-белковые комплексыРекомбинантные вирусыаденовирусыретровирусыРис.
1. Значение интеграции в геном для судьбы“лечебного” гена (изображен красным цветом).Не все системы доставки гена в клетки-мишениобеспечивают его включение (интеграцию) в геном. Если вектор не способен к интеграции, топривнесенная ДНК присутствует в ядре вне хромосом и не будет передаваться всем дочернимклеткам при клеточном делении. Это неминуемоприведет к потере “лечебного” гена. Напротив,интегрирующие векторы включают свои гены вхромосомы, что должно обеспечивать устойчивоеприобретение нового гена во всех последующихпоколенияхîÄÇéêéÇÄ é.é.
ãÖóÖçàÖ ÉÖçÄåà – îÄçíÄëíàäÄ àãà êÖÄãúçéëíú?23генов и не приводят к ощутимым повреждениям вклетке-мишени. В отличие от ретровирусных аденовирусные векторы в геном не интегрируются. Далее мы подробнее остановимся на строении ретровирусов и векторов на их основе.В начале статьи мы говорили о том, что генетическая информация записана в клетке в формеДНК. На матрице ДНК синтезируются разные типымолекул РНК, один из которых (информационная,или матричная, РНК) направляет синтез белков. Этофундаментальное положение, сформулированноена заре молекулярной биологии, получило название основной догмы молекулярной биологии (рис.
2). Всвоей первоначальной форме основная догма гласила, что в природе возможны синтез РНК на ДНКи синтез белка под контролем РНК, но ни в коемслучае не в обратном направлении. Однако в 1970году было установлено, что онкогенные, то есть вызывающие рак, РНК-содержащие вирусы животных(а все вирусы можно разделить на две большиегруппы в зависимости от того, какую нуклеиновуюкислоту – ДНК или РНК – они содержат в качествегенетического материала) способны синтезироватьРепликацияринсктраная?ОбратТранскрипцияпцияДНКРНКТрансляцияБелокРепликация/ТранскрипцияРис.
2. Пути передачи генетической информации. В соответствии с основной догмой молекулярной биологии генетическая информация передается в направлении ДНКРНКбелок(сплошные черные линии). Позднее у РНК-содержащих вирусов были обнаружены другие пути передачи генетической информации (красные линии): у одних – процессы обратной транскрипцииРНКДНК, у других – репликации/транскрипции РНКРНК. В принципе возможно, хотя ине обнаружено, считывание белка с матрицы ДНК(пунктирная черная линия). Запрещено только направление передачи генетической информацииот белка к нуклеиновым кислотам24ДНК на своей РНК как на матрице. Этот процессполучил название “обратной транскрипции” в отличие от прямой транскрипции ДНКРНК, а осуществляющие его вирусы, которые принципиальноотличаются от остальных живых организмов по типу превращения генома, стали называть ретровирусами (от лат. retro – обратно, назад).На рис.
3 схематически представлены строениечастиц ретровируса (слева вверху) и его жизненныйцикл. Сердцевина вируса, построенная из специальных вирусных белков, содержит две идентичныемолекулы одноцепочечной РНК, а также немногочисленные молекулы вирусных ферментов. Сердцевина окружена оболочкой, собранной из клеточныхмембран хозяина с вкраплениями еще одного вирусного белка. Последний обеспечивает прикреплениевируса к поверхности клетки. Вслед за этим происходят “раздевание” РНК и ее проникновение вместе с белками сердцевины вируса в клетку, где специальный вирусный фермент катализирует обратнуютранскрипцию РНК в ДНК. Двухцепочечная вирусная ДНК перемещается в клеточное ядро и встраивается в хромосому.
Это свойство ретровируса обеспечивает стабильное сохранение его генетическойинформации: реплицируясь вместе с клеточнойДНК при делении клетки, вирусспецифическаяДНК (провирус) передается в дочерние клетки. Провирус направляет синтез вирусных белков и РНК,которые затем собираются в частицы и выходят изклетки, отпочковываясь от клеточной мембраны.Еще одним уникальным свойством ретровирусовявляется то, что в составе их генома могут присутствовать последовательности нуклеотидов, которыеотличаются от собственных генов вируса и, как оказалось, захвачены из ДНК клетки-хозяина.
Такимобразом, для ретровирусов характерна передача генетической информации в направлении РНКДНКРНК, и они являются природными генетическими векторами. Теперь ясно, почему на ихоснове удобно создавать искусственные векторыдля переноса генов.Действительно, если лишить ретровирус генетического материала, кодирующего вирусные белки,то это приведет, как показано на рис. 3, к невозможности давать потомство новых вирусных частиц. Наосвободившееся в геноме вируса место можноввести чужеродный ген и таким образом создатьретровирусный вектор. А вот размножаться такойдефектный вирус сможет только в присутствиидругого вируса-помощника с неизмененной РНК,чьи белки будут “приватизированы” нашим вектором.
Именно так на основе вируса лейкоза мышейсконструированы векторы, которые обеспечиваютвысокоэффективный перенос генов и их стабильное встраивание в хромосому клеток-мишеней. Аесли уж вектор встроился в клеточную ДНК, то онбудет передаваться при нормальном делении всемупотомству этой клетки. Это свойство чрезвычайноважно для стойкого исправления генетическогоëéêéëéÇëäàâ éÅêÄáéÇÄíÖãúçõâ ÜìêçÄã, ‹2, 1997дефекта.
Несмотря на очевидные достоинства ретровирусных векторов, их возможности далеко небезграничны. Так, ретровирусная ДНК можетвстраиваться в хромосомную ДНК только тех клеДве молекулы одноцепочечной вирусной РНКОболочкавирусаФерментывирусаéÅãÄëíà èêàåÖçÖçàü ÉÖçéíÖêÄèààСердцевинавирусаРецепторЦитоплазмаКлеткаЯдроклеткиДвухцепочечнаявирусная ДНКПровирусВирусныеРНКток, которые способны к активному делению. Другим серьезным недостатком ретровирусных векторов является то, что они встраиваются в геномклеток хозяина беспорядочно, то есть в каждойклетке включение происходит в разные участки любой из хромосом. Это создает проблемы, из которыхотметим одну – теоретическую возможность злокачественного перерождения отдельных клеток хозяина из-за повреждения их генетического материалапри встраивании вектора. Тем не менее, как ужеуказывалось, достоинства ретровирусных векторовделают их основной системой доставки генов приклинических испытаниях.ХромосомнаяДНКВирусныебелкиРис.
3. Строение и жизненный цикл вируса лейкоза мышей. Созданные на его основе ретровирусные векторы не содержат некоторых генов, кодирующих вирусные белки, и потому в их жизненномцикле отсутствуют стадии, обведенные пунктирной линией. “Лечебные” гены, введенные вместовирусных, активно функционируютВ табл. 2 перечислены наследственные заболевания, которые пытаются лечить методом генотерапии. При упомянутом выше комбинированномиммунодефиците, связанном с дефектом аденозиндезаминазы, перенос “лечебного” гена производили в Т-лимфоциты крови (1990 год, США) или встволовые клетки костного мозга (1992 год, Италия;1993 год, Великобритания–Франция).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
