И.Б. Лещинская - Генетическая инженерия (статья) (1117873), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Но процесс рекомбинации – статистический, и нам не дано стопроцентно предугадать, какие признаки родителей унаследует потомство, ирезультат бывает иногда прямо противоположныможидаемому.Молекулярная биология вооружила ученых пониманием законов передачи от родителей потомству наследственной информации. Стали понятнымипричины ограничений классической селекции, атакже то обстоятельство, что природные механизмы, стоящие на страже чистоты и стабильности своего генома, преодолеть практически невозможно.А что если попытаться проводить рекомбинацию хромосом или отдельных генов вне организма(in vitro), в пробирке? Первые удачные эксперименты такого рода сделаны в 1972 году, и вскоре был создан арсенал приемов и методов, позволяющихпроизводить рекомбинацию генов in vitro, затемвводить полученную генную конструкцию в клетку,при этом в последней синтезируются продукты введенных генов.Таким образом, суть генной инженерии состоитв том, что процесс рекомбинации производится внеорганизма и таким образом преодолеваются всеограничения, с которыми сталкиваются ученые, используя приемы классической селекции.
Итак, теперь все стало можно: можно скрещивать отдель-34ные гены “ужа и ежа”, можно управлять процессом,можно предсказать результат (схема 2).Схема 2. Возможности генной инженерии1. Можно скрещивать индивидуальные гены видов,стоящих на разных ступенях эволюции. В основе рекомбинации гетерологичных ДНК in vitro лежитприем, позволяющий с помощью рестриктаз подготовить молекулы для скрещивания, то есть разрезатьразные ДНК с образованием одинаковых липкихконцов.2. Можно управлять процессом рекомбинации, так какон происходит в пробирке и не защищен запрещающими механизмами организма.3. Можно предсказать результат, т.к.
отбираетсяпотомство одной молекулы ДНК (молекулярноеклонирование).äÄä ùíé ÑÖãÄÖíëü?Как уже указывалось, процесс рекомбинации ворганизме (in vivo) возможен в большинстве случаевмежду гомологичными молекулами ДНК. Однакооказалось, что in vitro притягивание и взаимодействие (гибридизация) молекул ДНК возможно, еслиони будут иметь небольшие комплементарные односпиральные участки из четырех и более нуклеотидов на концах молекул (в настоящее время описаны двенадцатинуклеотидные липкие концы).
Такиекомплементарные односпиральные последовательности получили название липких концов, так какдве молекулы ДНК могут соединиться (слипнуться)этими концами. Таким образом, если в пробиркупоместить самые разные молекулы ДНК с одинаковыми липкими концами, то будет происходить рекомбинация, даже если вся их структура очень различается.Как же получить гетерогенные молекулы ДНК содинаковыми липкими концами? Для этого используются ферменты-рестриктазы, которые “умеют” разрезать молекулы ДНК так, что у нихобразуются одинаковые (комплементарные) липкие концы. Происходит такое разрезание в участках, несущих особым образом повторяющиесяпоследовательности нуклеотидов.
Рестриктазы узнают эти последовательности и разрезают ДНК вточках повтора: в результате односпиральный конец одной молекулы оказывается комплементарным (липким) концу другой молекулы.Теперь, чтобы полученные в пробирке генныеконструкции заработали, необходимо их ввести вподходящую бактериальную клетку. Вот тут-то ипригодятся плазмиды.
В генной инженерии их называют векторами (повозки, которые доставляют вклетку клонируемый ген). Для этого плазмиды тожережут рестриктазами, чтобы получить односпиральные концы, комплементарные концам генов,проводят гибридизацию гена и плазмиды в пробирке, а затем рекомбинантную плазмиду (ее называютеще химерной) вводят в клетку. Плазмиды, которыеëéêéëéÇëäàâ éÅêÄáéÇÄíÖãúçõâ ÜìêçÄã, ‹1, 1996используются в генной инженерии, имеют оченьважное свойство: они содержат так называемыймаркерный ген, например ген, сообщающий клеткеустойчивость к определенному антибиотику.
Благодаря этому клетки, несущие рекомбинантную плазмиду, легко отделить от клеток, не имеющих такойплазмиды. Для этого бактерии высевают на среду сантибиотиком, на которой будут расти только клетки с плазмидой – так называемые рекомбинантныеклетки, а процедура их отбора получила названиемолекулярного клонирования, так как рекомбинантные клетки представляют собой потомство одной молекулы ДНК [4, 5].В рекомбинантных клетках химерная плазмида,несущая чужеродный ген, начинает функционировать, то есть совершаются процессы репликации,транскрипции и трансляции нового введенного вклетку гена и синтезируется продукт этого гена, который в природных клетках никогда ранее не могобразоваться.
Таким образом, in vitro проводитсятолько рекомбинация, а все остальные превращения с химерной плазмидой происходят в клетке также, как и со своими собственными генами. Инымисловами, теперь можно ввести в бактериальнуюклетку ген, полученный из любого организма —слона, носорога, обезьяны и ... даже человека, и заставить чужеродный ген там функционировать.Итак, основные процедуры в генной инженериисводятся к следующему:1) рекомбинация in vitro ДНК-вектора иДНК-гена;2) введение рекомбинантной плазмиды в клетку;3) молекулярное клонирование.Схематически ход эксперимента показан на рис.
1.çÖäéíéêõÖ çÄìóçõÖ êÖáìãúíÄíõУже первые шаги в области изучения рекомбинантных молекул позволили считать, что достигнутне просто успех, но осуществлен прорыв,открывающий новые пути для познания наследственности. Возникли исключительные условия дляизучения механизмов функционирования и структурной организации генома, в том числе и геномачеловека. Используя методы генной инженерии,ученые сделали много поразительных открытий.К одному из них относится явление дискретностигенов эукариот. Если раньше было признано положение о коллинеарном переносе генетической информации от ДНК на мРНК и от мРНК на блок, тосейчас установлено, что гены животных и растенийимеют внутри такие последовательности, которыепосле транскрипции удаляются и не копируются вструктуре белка.
Значимые части гена назвали экзонами, а удаляемые части — интронами. Последовательности РНК, соответствующие интронам, вырезаются и не транслируются, а последовательности,соответствующие экзонам, сшиваются специальными ферментами. Процесс получил названиесплайсинг (рис. 2).ãÖôàçëäÄü à.Å. ÉÖçÖíàóÖëäÄü àçÜÖçÖêàüДругое очень важное открытие состоит в следующем. Было известно, что у бактерий, да и не только у них, в составе генома имеются такие гены,которые перемещаются, мигрируют, меняют своеместо на хромосоме. Генная инженерия позволилаглубже проникнуть в природу подвижных элементов, изучить их структуру, механизмы действия ибиологическую роль.
Именно при перемещенииподвижных элементов (транспозонов) и происходит часто негомологичная рекомбинация.çÄàÅéãÖÖ ÇèÖóÄíãüûôàÖ èêÄäíàóÖëäàÖëÇÖêòÖçàüÉÂÌ̇fl ËÌÊÂÌÂËfl — ωˈËÌÂСреди многих достижений генной инженерии,получивших применение в медицине, наиболеезначительное — получение человеческого инсулинав промышленных масштабах.Всем широко и печально известна такая болезнь,как сахарный диабет, когда организм человека утрачивает способность вырабатывать физиологическиважный гормон — инсулин. В результате в крови накапливается сахар и больной может погибнуть. Инсулин уже давно получают из органов животных ииспользуют в медицинской практике. Однако многолетнее применение животного инсулина ведет кнеобратимому поражению многих органов пациентаиз-за иммунологических реакций, вызываемых инъекцией чужеродного человеческому организму животного инсулина.
Но даже потребности в животноминсулине до недавнего времени удовлетворялисьвсего на 60 – 70%. Так, в 1979 году из 6 млн. больныхво всем мире только 4 млн. получали инсулин. Безлечения инсулином больные умирали. А еслиучесть, что среди больных диабетом немало детей,становится понятным, что для многих стран это заболевание превращается в национальную трагедию.Генные инженеры в качестве первой практической задачи решили клонировать ген инсулина. Клонированные гены человеческого инсулина быливведены с плазмидой в бактериальную клетку, гденачался синтез гормона, который природныемикробные штаммы никогда не синтезировали. Начиная с 1982 года фирмы США, Японии, Великобритании и других стран производят генно-инженерный инсулин. Проблема решена. Из 1000 литровбактериальной культуры получают приблизительно200 г инсулина, что равно количеству, получаемомуиз 1600 кг поджелудочной железы животных.
Параллельно была решена проблема иммунологического поражения организмов диабетиков животныминсулином.Производство и продажу инсулина впервые начала американская фирма Eli Lilly. Мировой рынок инсулина составляет в настоящее время более400 млн. долларов, ежегодное потребление около2500 кг.Более двадцати фирм Японии и несколькоамериканских фирм разрабатывали другой очень35Липкие концыВстречаемаягетерологичная ДНКРекомбинацияin vitroПлазмидаМаркер устойчивостик антибиотикуРекомбинантнаяплазмидаВведение в бактериальные клеткиОтбор клеток, содержащих рекомбинантные молекулы ДНК,по способности расти в присутствии антибиотикаРис.
1. Клонирование фрагмента ДНК в плазмиде.важный медицинский препарат — интерферон, который эффективен при различных вирусныхзаболеваниях и злокачественных новообразованиях.Первым из этих соединений на рынок поступилальфа-интерферон, затем бета-интерферон.Еще один эффективный противораковый препарат — интерлейкин — производится в Японии иСША. Интересно отметить, что сегодня американский рынок медицинских препаратов, полученныхметодами генной инженерии, сравним с такими массовыми лекарствами, как антибиотики. К 2000 годустоимость продукции, выпускаемой в США наоснове генно-инженерных методов, достигнет50 млрд. долларов в год.Около 200 новых диагностических препаратовуже введены в медицинскую практику, и более 100генно-инженерных лекарственных веществ находится на стадии клинического изучения.
Среди нихлекарства, излечивающие артрозы, сердечно-сосудистые заболевания, некоторые опухолевые процессы и, возможно, даже СПИД. Среди нескольких36сотен генно-инженерных фирм 60% работают надпроизводством лекарственных и диагностическихпрепаратов.ÉÂÌÓÚ‡ÔËflНеблагоприятная экологическая обстановка ицелый ряд других подобных причин приводят к тому, что все больше детей рождается с серьезныминаследственными дефектами. В настоящее времяизвестно 4000 наследственных заболеваний, длябольшинства из которых не найдено эффективныхспособов лечения.Генные инженеры уже внесли свой вклад в решение этой проблемы, разработав диагностическиепрепараты, позволяющие обнаруживать генетические аномалии в период беременности, что даетвозможность предотвратить рождение больногоребенка.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
