И.Ф. Жимулёв - Общая и молекулярная генетика (1117666), страница 60
Текст из файла (страница 60)
Организмы. полученные в результате внедрения чужеродного генетического материала, называют трансгенными. Чем принципиально генная инженерия отличается от классической селекции'? В отличие от генных инженеров селекционеры при получении новых сортов растений, пород животных или рас микроорганизмов сталкиваются со следующими ограничениями: 1) нельзя скрещивать неродственные виды; 2) нельзя управлять процессом рекомбинации в организме„ 3) нельзя предугадать, какое получится потомство.
Технологии, возникшие на основе методов молекулярной генетики, используются в самых разнообразных областях, таких как диагностика наследственных заболеваний у человека и животных, криминалистика и этнография, производство хозяйственно ценных и биологически активных веществ, получение штаммов микроорганизмов, трансгенных животных и растений с заданными свойствами, клонирование целых организмов, органов или отдельных клеток.
Некоторые из этих вопросов будут кратко рассмотрены ниже. 7.11.1. Стратегия генно-инженерных работ Генно-инженерные работы выполняются в несколько этапов. Ееж!п В. Оепеа. ОхГог0; !4егя Уог!с; То1суо: Ох!ог0 Нпгяеггй!у Ргезя, !994. Р. 726 — 728. Впязе)! Р.,!. Оепебсв. 5Я ес!. Меп!о Раск, Са!!Гога|а: Апп!аоп %ев!еу Еоп8шап !пс., !998. Р. 400— 408. 1. Получают нужный ген, готовый для последующих процедур трансгенеза.
Ген может быль выделен из естественных источников !из подходящего генома), синтезирован химически по имеющейся последовательности нуклеотидов, получен с помощьн1 полимеразной цепной реакции или путем копирования ДНК на РНК-матрице с использованием обратной транскриптазы. 2. Подбирают вектор, обладающий всеми необходимыми характеристиками. 3.
Вектор и клонируемый ген обрабатывают одинаковыми рестриктазами. 4. Сшивают вектор и встроенный ген с помощью ДНК-лигазы. 5. Вводят рекомбинантную конструкцию из вектора и встроенного гена в клетки-мишени реципиента -- осуществляют трансформацию. б. Проверяют наличие трансгена в клетках- мишенях. Для этого используют маркерные гены, которые находятся в молекуле-векторе наряду с трансгеном. Это гены, контролирующие устойчивость к антибиотикам или гербицидам. Поэтому на фоне соответствующих гербицидов или антибиотиков будут развиваться только те клетки, которые содержат гены устойчивости к ним„т. е.
вектор со встроенным в него трансгеном. Рассмотрим подробнее некоторые из этих процедур. 7.11.1.1. Выделение ДНК нужного гена из генома Эта часть работы является наиболее трудным этапом во всех процедурах генной инженерии„поскольку из многих тысяч генов, имеющихся в геноме, нужно выделить единственный конкретный ген, контролирующий развитие того или иного признака или кодирующий вполне определенный белок. Точный и эффективный метод выделения определенных генов у дрозофилы (метод «спасения» плазмиды) разработан в лаборатории В. Геринга в 1989 г. В данном случае используется плазмида р-)АгВ !рис.
7.78, а). Она содержит концевые участки мобильного Р-элемента, а также гены lас7 из Е. сой, Асй и гу Ггаеа 7. СТРУКТУРА ГЕНА Р-!.4гВ и В!негсг!рг я М!З«КВ Р1 2 РЕЗ РЕ4З Р 1дсбш, Суа1, Яа!. Лтю1, лра1. Кря! Ваг1, Вг!Х1, Ваги, й!аг1, ЗУ!1, Ьрс1, ВамН1 1асУ,ИЬ я Ф ИИ 5 Р Р1 1 Гспоыпая ДНК Трансформация О Ф В1«аяеирг гт г1 ням ь 3 Гснпмнык фрлгыенг Р«М~В $ мяя Селекция по устойчивости к емпициллину Лнгнронанне ипнпп В!аггг прг т Фрагменты 1-1егл '(„~' М Нпзсрп-блот Гибридизация пг рйн я Саузергыблот Элсктрофорсз в агарозном геле Другие гспоыпыс фрагменты Саузерп-блпт Структура плазмнды Р-1АгВ (а) н метод «спасения» плазмиды (В) (цгг!!яоп е1 я!., !ЧК9), Объяснения в тексте из генома дрозофилы и плазмиду В1иеясг!Р! (см. разд. 7.4.2.1).
Эти гены отделены друг от друга полилинкерными участками (Р(.!— Р1.4), содержащими многие сайты рестрикции. Из них Р(.3 содержит шесть сайтов рестрикции, которые не встречаются в участках плазмиды ниже Р1.3. Сайт Аго1! является уникальным во всей конструкции. Сначала, используя Р-элемент-помощник — источник транспозазы, мобилизуют перемещения Р-1АгВ. Этот транспозон встраивается в различные гены, вьпывая мутации. Таким образом, по мутант- ному фенотипу отбирают встройку в нужный ген. Затем ДНК из этой линии выделяют и разрезакгт, используя один из ферментов рестрикции, имеющих сайт узнавания в РЬЗ, например 11!не)111. Образовавшиеся фрагменты лигируют (рис.
7.78, б). Получается большой набор фрагментов ДНК, которыми трансформируют компетентные клетки Е. сой, помещенные на газон с ампициллином. Имеют шанс выжить только те кольцевые фрагменты„которые содержат плазмиду В1иекск1Р1, несущую ген устойчивости к ампициллину, и часть при- лежащей геномной ДНК дрозофилы. В результате последующей совместной обработки данного кольца рестриктазами збоД и Е(гпд1П получаются два фрагмента: один содержит плазмиду В1иеясг!Рт, второй - — 3'-коиец Р-элемента н прилежащий участок генома дрозофилы. Эти фрагменты можно выделить и использовать в качестве зондов для Саузерн- и Нозерн-электрофорезов, а также для гибридизации т и!и.
После того как фрагмент, прилежащий к месту встраивания, получен (а это, скорее всего, участок гена), можно, используя «хромосомную ходьбу», проклонировать протяженный участок генома. В некоторых случаях для получения ДНК гена используют метод «хромосомных прыжков». Он позволяет обходить большие участки хромосомной ДНК, особенно районы, клонировать которые затруднительно (например, длинные тяжи повторов). Можно попытаться получить ДНК гена из генома одного организма, используя гомологичный ген другого вида. ОБщАя и мОлекуляРИАя ГенетикА 7.11.).2. Перенос генов в клетки других организмов ОжатыГ1 воздух В: Золотыс дробинки с ДИК Клетки Схема действия (а) н внешний вид (б) «генной пушки» конструкции Р. К. Саляева Известны многочисленные методы.
с помощью которых можно внедрить чужеродную ДНК в геном того или иного организма. В качестве реципиентов, в геном которых встраиваются чужеродные гены, используют клетки культуры, эмбриональные клетки млекопитающих. некоторых растений, дрозофилы, пронуклеусы млекопитающих, у растений--- протопласты, изолированнзле клетки и ткани, микроспоры, незрелые зиготические зародыши. Мпкроиньекция. С помощью тонких стеклянных микропипеток (днаметром 0,1-0,5 мкм) и микроманипулятора можно ввести в ядро клетки млекопитающих векторную ДНК с включенным в нее трансгеном.
Эффективность (частота интеграции трансгена в геном) такой трансформации достигает 50»', т. е. в 50 из 100 инъецированных клеток происходит трансформация. Число молекул ДНК, вводимых за одну инъекцию, колеблется от 100 до 300 000. С помощью микроинъекций осуществляется трансформация у дрозофилы (см. разд. 7.4.10). Для мнкроинъекций в клетки растений используются микроиглы с наружным диаметром 2 мкм.
Трансформация растительных клеток происходит с эффективностью 10-20;'» независимо от типа вектора. Электропорация. Метод основан на том, что импульсы высокого напряжения обратимо увеличивают проницаемость биомембран. На растительные протопласты (или животные клетки) и находящуюся в окружающей среде ДНК действуют высоковольтным импульсом (200--350 В, длительность 54 мс). Через образующиеся на короткое время поры ДНК проникает в клетку. Трацсфекция. Это встраивание чужеродной ДНК в культивируемые эукариотические клетки в результате обработки нх изолированной ДНК. Эффективного поглощения ДНК удалось достичь при добавлении к ней ионов кальция. Предполагают. что клетки преимущественно поглощают частицы кальциевого преципитата ДНК по механизму фагоцитоза, а затем небольшая часть проникших в клетку молекул встраивается в хромосомную ДНК.
Упаковка в лппосомы. Это один из методов, используемых для защиты трансформирующего генетического материала от разрушительного действия нуклеаз, присутствующих вне клеток. Липосомы — это сферические образования, оболочки которых состоят из фосфолипидов н внутри которых располагается трансформирующая ДНК. Липосомы захватываются клетками, и ДНК попадает внутрь.
Бомбардировацие микрочастицами. Это один из самых эффективных методов трансформации однодольных растений. В качестве исходного материала для трансформации берется суспензионная культура, каллусная ткань или 4-5-дневные культивируемые незрелые зародыши однодольных. Для бомбардирования используют частицы золота или вольфрама размером 0,6-3 мкм, на которые наносится Ганса 7. СТРУКТУРА ГГ!1А ДНК вектора, содержащего необходимый для трансформирования трансген. Этими частицами заряжают «генные пушки», после выстрелов из которых частицы, содержащие гены, проникают в клетки и ядра. Клетки в направлении выстрела чаще всего гибнут, в то время как в зоне 0,6-1 см от центра находятся наиболее удачно трансформированные клетки.
ь!астнцы могут проникать па глубину 2--3 клеточных слоев. Удивительную по простоте и дешевизне конструкцию «генной пушки» предложил Р. К. Саляев !рис. 7.79). По его замыслу металлические шарики, на которые нанесена ДНК, прикрепляются на фронтальную сторону тефлоновой пульки от духового ружья. На свободный конец ствола надевается специальная насадка.
После выстрела пуля вылетает из ствола н застревает в отверстии насадки. Золотые !вольфрамовые) шарики с прикрепленной ДНК в силу ннерпии отрываются, летят в сторону клеточной суспензии. помещенной в !0--15 см от конца насадки, и прошивают клетки и ядра. 7.11.2. Задачи и достижения биотехнологии 7.11.2 1. Биотехнология растений Генетически трансформированные растения впервые были получены в 1982 г.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
