И.Ф. Жимулёв - Общая и молекулярная генетика (1117666), страница 32
Текст из файла (страница 32)
другая половина имеет родительский генотип а сами. Уже после первого раунда репликации ДНК образуются два типа клеток: исходные и трансформированные, которые несут ДНК донора. Первые стадии трансформации — присоединение ДНК к клеточной оболочке, ее поглощение и деградация одной цепи — осуществляются с равной эффективностью независимо от ее гомологии с ДНК реципиента. Однако процесс рекомбинации специфичен в отношении гомологичной ДНК и с негомологичной происходит с очень низкой частотой.
Минимальная длина цепочки ДНК, способной интегрироваться в реципиентскую хромосому, составляет около 500 пи (пар нуклеотидов). Однако обычно в рекомбинации участвуют фрагменты донорной ДНК длиной около 200 тпн 1тысяч пар нуклеотидов), или около 11200 всей бактериальной хромосомы. Частота трансформации по хромосомным маркерам зависит от свойств данного препарата ДНК, ее концентрации, состояния клетки реципиента, вида бактерий. У пневмококков при селекции по одиночному маркеру частота трансформации составляет 10'-10 ' на одну клетку реципиента.
У гемофильных бактерий частота трансформации варьирует от !О' до 10'. Трансформация, хотя и с очень низкой частотой, может происходить даже между разными видами бактерий, что помогает установить степень родства между ними. ДНК, освобождаиэщаяся в окружающую среду при лизисе стареющих культур бактерий, в природных условиях обладает трансформирующей активностью. Это значит, что трансформация является одним из природных способов обмена генетическим материалом у бактерий. Трансформация используется также для генетического картирования у бактерий. Как уже отмечаюсь, при трансформации в хромосому реципиента встраивается сравнительно небольшой фрагмент ДНК.
Если два гена находятся в хромосоме на значительном расстоянии друг от друга, они не могут локализоваться в одном и том же фрагменте трансформирующей ДНК. Одновременная трансформация 1котрансформация) двумя независимыми фрагментами, содержащими эти гены, — -событие крайне маловероятное. Таким образом„ частота котрансформации двух генетических маркеров служит показателем расстояния между ними (рис. 5.19). Например, если гены р и 9 часто передаются реципиенту вместе, то они и в хромосоме расположены рядом. Аналогично оценивается степень близости генов д и а.
Чтобы определить порядок этих трех генов, нужно знать, как передаются гены р и о. Теоретически возможны два варианта: р.о-д и р-д.о. Если гены расположены в соответствии с первой последовательностью, р и и должны котрансформироваться чаще, чем р и 9. Однако результаты опыта (см. рис. 5.19) свидетельствуют об отсутствии котрансформации р и а, что прямо указывает на то, что гены расположены в порядке р-9-о. 98 ОБШАЯ И МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА Донорская ДИК Бактсрня-линор 100 нм !00 нм Генотип).) рспиписптпг)х оактсрий посля трапсфармачии р а о' Трапсформапия рапиписптной бак"гсрии фрагментами ДНК из покорной бактерии Олектроина-микроскопические фотографии и схемы строения бактериофагов Т4 !о) и 2 !б) !Кпаас!1, 1998. Р. 238) Определение порядка генов при котрансфармации !абьяснения а тексте) !КпааеП, 1998.
Р. 229) Присоединение фаговой частипы к клетке й. гойи ее заражение фаговой ДПК Крок)асима кзстки-хозяина Лизис клетки-козинца и выъод фаговык частиц во внешнюю среду Хромосома фага Клетка Рйсо!! Сборка фаговыя частиц Синтез бе.гкавых компонентов фаговыя частиц Жизненный цикл аирулентнога фага, например Т2 или Т4 !Кцаае)1, 1998. Р. 239) Вылсяси и с ДН К нз папу:нции ,)опорных бактерий, ДНК ленится па фрагменты Р+9 о рго о о О о+ Разрушение бактериальпои хромосомы ферментами фага Репликация фаговыт ярамасг>м с использованием ресурсов клетки п ферментов фага Гомо 5.
ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ: КАРТИРОВАНИЕ ГЕНОВ 5.12. ТРАНСДУКЦИЯ Лнзнс клетки-хозяина н выход фатов Х во ивешиюю среду Синтез белковых компоп«птов фаговых частиц и сворка фигов М Хромосома клюки-хозлинв Хромосома фага х Клсткв К сод Встраивание хромосомы фага )с в хровюепму клетки"хоэизтна Экспизии хромосомы фага ) Хромосома фага ). Индукции литического цикла Клеточные деления Жизненный цикл умеренного фага, например 2 (Ковке!1, 1998. Р. 240) Когда такой фвг иифицирует клетку, развитие может пойти по литичсскому или лизогенному пути Трансдукцией называется перенос ДНК из одной клетки (донор) в другую (рецнпиент) с помощью бактериофагов (рис.
5.20-5.22). Этот способ генетического обмена бьп открыл в 1952 г. Н. Зиндером и Дж. Ледербергом (М. 2(ос(ег, 1. 1 едегЪегц) у Ба1топе11а 0у)1))тиг)ит. Различают три типа трансдукции: общую (неспецифическую), ограниченную (специфическую) и абортнвную. Общая трансдукция. В экспериментах 11-образная трубка в нижней части была разделена посередине бактериальным фильтром. В одну половину этой трубки были помещены тифозные бактерии штамма 22А, а в другую половину — — штамма 2А (рис. 5.23). При этом бактериальные клетки не хюгли переходить через фильтр. Штамм 22А нес мутацию, блокирующую синтез триптофана (Т ), штамм 2А— 1ОО ОБЩАЯ 1Л МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА Ген Г Ген Т' Лизированная кэсткв Фнзьгр Бзкгсриефзг Р" 2 Схема опьпа, деманстриругощего явление транслукцнн у Ва1тсгпе(1п гурйниигтггт: 22А — шталгм бактерий, не способных синтезировать три пгофан ( Т 1: 2А — ш гам лг бакгернй, нс сне собных синтезировать гнстиднн (й 1 блокирующую синтез гистидина (Н ).
После инкубации этих двух разных штаммов в трубке, разделенной фильтром, был произведен рассев клеток обоих штаммов. При рассеве клеток штамма 22А на среде без триптофана было обнаружено небольшое число колоний. Следовательно, некоторые клетки приобрели способность синтезировать триптофан и смогли дать колонии н» среде без этой аминокислоты. Фильтрующимся агентом, переносящим ген Т' от штамма 2А к штамму 22А, оказался бактериофаг.
В случае общей трансдукции фрагменты бактериальной донорной ДНК случайно включаются в созревающую ча- Конъюгацией у бактерий называют однонаправленную передачу генетической информации в результате непосредственного контакта между донорной и реципиентской клетками, к е. фактически полового процесса. Наличие полового процесса у бактерий было доказано следующим образом: у Е. сой был получен ряд биохимических мутантов с потребностями в биотине (В ), метионине (М ), проливе (Р ), треонине (Т ). Все эти штаммы не росли на минимальной среде. В опытах Дж. Ледерберга и Э.
Тейтума (1946 г.) были взяты два штамма, различающиеся по генотипу; В М Р"Т" и В'М"Р Т . 5.13. КОНЪ!ОГАЦИЯ стицу вместе с фаговой ДНК или даже вместо нее (рис. 5.24). При этом бактерия-донор через фаг передает реципиенту лишь отдельный фрагмент ДНК длиной 1)50 — 11100 от всей бактериальной хромосомы. Обнаружение котрансдуцируемости двух или более генетических маркеров указывает на их сцепленность, а по частоте такой котрансдукции можно судить о порядке расположения маркеров на генетической карте. Например, если маркеры а' и Ь', а также Ь' и с' котрансдуцируются попарно, а а' и с' не котрансдуцируются, следовательно, они локализуются в порядке а-Ь-с. Величина трансдуцируемого фрагмента определяется размером ДНК донора, способной упаковаться в головку фага.
Доказано, что в частицах трансдуцирующего фага практически вся фаговая ДНК может быть заменена на бактериальную. Поскольку ДНК фага Р! состоит примерно из 1Оз тпн, а хромосома Е. сой--- примерно из 4 х 1Оз тпн, то фрагмент хромосомной ДНК„способный включиться в трансдуцирующую частицу, составляет около 2,3 % хромосомы Е. сей. Если исходить из того, что длина среднего гена равна 1 тпн, то при трансдукции фагом Р! возможен совместный перенос около 100 генов, а, например, фатом Р22— около 40 генов.
Ограниченная трансдукция. При ограниченной трансдукции происходит рекомбинация между фаговой и хромосомной бактериальной ДНК, поэтому фаговые трансдуцирующие частицы обязательно содержат ДНК обоих типов. Абпртивная трансдукция. Трансдуцируемый фатом фрагмент ДНК донора не включается в хромосому клетки-реципиента, а остается в ее цитоплазме и в таком виде способен поддерживаться и проявляться фенотипически. Клетки обоих ауксотрофных штаммов в течение некоторого времени выращивали в смешанной культуре, а затем высевали на минимальную среду.
Ни один из двух исходных штаммов не мог расти на этой среде. Однако на каждые 10' посеянных клеток из смешанной культуры на минимальной среде выраста- В 1958 г. зв открытие генетической рекомбинации и организации генетического материала у бактерий Дж. Ледербергу (3. Еег(егЬегя) была присуждена Нобелевская премия. Глава 5.
ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ: КАРТИРОВАНИЕ ГЕНОВ 101 Фаг Р1 Хромосома клетки-хозяина Хромосома фага Р1 Клетка-донор )дикий тип) Фрагменты бакгерналызоп хромосомы Порчальныс фага )г Хромосома клетки-реципиента 1мутант по л) Траосдуцнрующне фагн Схема общей трансдукции между линиями Е.соГп а — клетка дикого типа, инфицированная фагом Р1; б — ДНК клетки-хозяина деградирует в ходе литического цикла; е — в ходе сборки фаговых наствц некоторые фрагменты бактериальной хролюсомы вклюлсны в некоторые фаги-потомки, что потом приведет к трансдукцин; г — лнзис: д — трансдуцнрующнй фаг инфицирует ауксотрофную бактерию-рецнпиент: е — двойной кроссинговер приводит к обменам лонорного гена а' н реципиентного гена а; ас — образование стабильного трансдуктанта а' ОБ!11ля и мОлекуляР!!ля ГБВГтикл Коыъкл алия у Е, согь Яигектроыггая микрофотография Р' клетки (слева). связанной с Р клеткой (справа) половой ворсинкой — Р-лилем (Квязе!1.
19г18. Р. 2241 ло около 100 колоний. По генотипу эти клетки могли быть только Ьи ИР:Т'. Чтобы установить, нужен ли для процесса передачи информации физический контакт клеток, Ь. Дэйвис (В. Пав!в) поместил оба штамма в (3-образную трубку, плечи которой были разделены бактериальным фильтром.
После нескольких часов ипкубации он высеял клетки на минимальнуго среду. Колонии на ней не выросли. Отсюда следовал вывод о том, что для появления рекомбинантов необходим непосредственный контакт мелинду бактериальными клетками. Это заклкигение было сделано на основе чисто генетических экспериментов. Позднее с помощью электронной микроскопии были получены фотографии конъгогирукгшнх бактерий, соединенных друг с другом тонким мостиком-лилем (рис. 5.25). Эти данные свидетельствовали о том„что Е.гю)г имеет определенный тип скрещивания, называемый коньюгацией, когда генетический материал может передаваться между клетками, временно находящимися в конт акте.
В 1953 г. У. Хэйес (гт'. Науея) установил, что обмен информацией у оактерий происходит только в одном направлении. Исследованные штаммы первоначально распались на две группы. В первой группе коньюгацци клеток не бьшо. Во второй группе она происходила, но число рекомбицантов было небольшим. Представители разных групп вступали в коньюгациго друг с другом в 100-- 1000 раз чаще. Их стали рассматривать в качестве разных половых типов — — Р и Р" (Р—— значит 1егт!1!(у). Скрещивания бактерий штаммов Р' х Р всегда безуспешны, а Р' х Г лишь изредка дают рекомбинацию.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
