Комплексы полиамфолитов с липидными мембранами - формирование, строение и свойства (1105584), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Размер (гидродинамический диаметр) липосом колебался от экспериментак эксперименту, но не выходил за пределы интервала 50-80 нм. Электрофоретическуюподвижность (ЭФП) липосом определяли методом лазерного микроэлектрофореза. ВработеиспользовалитакжеметодыфлуоресцентнойиИКспектроскопии,дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК), кондуктометрии. Воду дляприготовлениярастворовочищалидвойнойперегонкойспоследующимпоследовательным пропусканием через ионообменные, адсорбционные колонки и фильтр5для удаления крупных частиц. Эксперименты проводились в 0,01 М фосфатном илиборатном буферных растворах с рН 7,0 или 9,2 соответственно.Таблица 1. Составы использованных в работе полиамфолитов.Группа полимеровПБnα = k/(k+m), δ = m/(k+m)ПолимерαПБ1 (n=1)0,980,02ПБ2 (n=2)0,980,02ПБ3 (n=3)0,700,25ПБ4 (n=4)0,680,32ПБ5 (n=5)0,730,27ПБК-50,330,630,04ПБК-40,390,570,04ПБК-30,500,450,05ПБК-20,580,280,04ПБК-10,800,160,04ПБЦ-10,930,030,04ПБЦ-20,900,050,05ПБЦ-30,900,080,02ПБЦ-40,840,130,03ПБКα= k/(k+l+m), β = l/(k+l+m),δ = m/(k+l+m)ПБЦα = k/(k+l+m), γ = l/(k+l+m),δ = m/(k+l+m)6βγδO-Na+O-Na+OH2COPN+(CH3)3O-Na+O CH2 CH2OPO CH2 CHOOCH2CH2CHOOCCRRH2COOOOHOOCCRROOCH2OHCH2H2CCHPN+(CH3)3H2C CH2OCHOOCCOR (CH2)5ONHNФХ (R = C16-C20)ДПФХ (R = С15)O1-ДОФГ (R = C17)NNO2O-Na+OH2COPO-Na+OHO CH2 CH CH2 OPOOCH2CH2CHOOCCRRHCOOДПФЭ-НБД (R = C15)OCH2OOCCRRO-NH4+OOPOO CH2 CH2 NH COOCH2H2C2-КЛ (R = С16-С20)OCCHOOCCRROOOO-NH4+OHДОФЭА-КФ (R = C17)Рисунок 1.
Структурные формулы использованных в работе липидов.ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.1. Комплексы ПБn с анионными липосомами.Известно, что кватернизованные производные поли-4-винилпиридина являютсяэффективными тушителями флуоресценции. Поскольку в синтезированных нами7полибетаинах (ПБn, Таблица 1) также присутствуют катионные пиридиниевые группы,естественнобылоиспользоватьметодтушенияфлуоресценциидляконтролякомплексообразования в системе полибетаин – анионная липосома.Как следует из данных Рис. 2, добавление растворов различных полибетаинов ксуспензии ФХ/КЛ2- липосом, в мембрану которых был встроен флуоресцентно меченыйлипид (ДОФЭА-КФ), по-разному сказывалось на интенсивности флуоресценции метки.ПБ1 слабо влиял на флуоресценцию метки (Рис.
2, кривая 1), ПБ2 и ПБ5 вызывализаметное тушение флуоресценции (Рис. 2, кривые 2 и 4), в то время как ПБ3 спромежуточной длиной развязки оказался менее эффективным тушителем (Рис. 2, кривая3).1Флуоресценция, о.е.1,00,9Рисунок0,8Зависимостьотносительной30,72.флуоресценции0,6интенсивностимеченыхФХ/КЛ2-липосом от концентрации ПБ. ПБ1 (1),0,540,40,3ПБ2 (2), ПБ3 (3), ПБ5 (4).
Суммарнаяконцентрация липидов 1 мг/мл; 10-2М,20,20124[ПБn]*10 , М3боратный буфер; pH 9,2.Тушение флуоресценции, в разной степени наблюдавшееся для ПБ2, ПБ3 и ПБ5,очевидно, являлось результатом адсорбции этих полимеров на поверхности анионныхлипосом. В случае ПБ1 с минимальной длиной развязки в бетаиновой группе низкаяэффективность тушения отражала его слабое связывание с липосомами.Эти выводы находятся в согласии с результатами экспериментов по измерениюразмеров частиц в супензиях в присутствии полибетаинов.
Так, размер липосомпрактически не менялся при добавлении инертного ПБ1 (Рис. 3, кривая 1); напротив,взаимодействовавший с липосомами ПБ3 инициировал агрегацию липосом, чтоотражалось на увеличении среднего размера частиц в системе (Рис. 3, кривая 2).Инертность ПБ1 по отношению к липосомам ФХ/КЛ2- может быть следствиемстроения его бетаиновых группировок, в которых положительные и отрицательныезаряды разделены всего одной метиленовой группой.
Такое сближение зарядов понижаетспособность катионных пиридиниевых групп в ПБ1 образовывать солевые связи с8фосфатными группами КЛ2-. Рост числа метиленовых групп приводит к увеличениюэффективного дипольного момента бетаиновой группировки и, как следствие, кГидродинамический диаметр, мкмсвязыванию полибетаинов с липосомами.2Рисунок 3. Зависимость размерачастиц в системе ПБ – ФХ/КЛ2-1,0липосомы от концентрации ПБ.
ПБ1(1)и(2).ПБ3Суммарнаяконцентрация липидов 1 мг/мл; 10-2М0,5боратный буфер; pH 9,2.10,002464[ПБn]*10 , М810За устойчивостью комплексов ПБ-липосома в водно-солевых средах следили спомощью метода флуоресценции. Выше отмечалось, что связывание полибетаинов вкомплекс с флуоресцентно мечеными ДОФЭА-КФ липосомами сопровождалосьтушением флуоресценции метки (Рис. 2). Последующее добавление раствора NaCl ксуспензиям комплексов полибетаин-липосома приводило к различным результатам.
Длякомплексов с участием ПБ2 и ПБ5 наблюдалось полное восстановление интенсивностифлуоресценции метки, т.е. диссоциация этих комплексов на исходные компоненты, при[NaCl] = 0,05 М (Рис. 4, кривые 1 и 3). Это указывает на электростатическую природувзаимодействия этих полибетаинов с ФХ/КЛ2- липосомами.Флуоресценция, о.е.Рисунок31,010,8относительнойинтенсивностикомплексаПБ-меченые ФХ/КЛ2- липосомы от0,6концентрацииNaCl.[ПБ]=2,5×10-4 М. ПБ2 (1), ПБ3 (2) и ПБ50,40,00,00Зависимостьфлуоресценции20,24.(3).ФизиологическаяСуммарнаялипидов0,050,100,150,20[NaCl], M91концентрациямг/мл;буфер, 10-2М; pH 9.2.боратныйЧто касается комплекса с участием ПБ3, его флуоресценция практически неменялась (т.е. комплекс не диссоциировал) при увеличении концентрации соли (Рис.
4,кривая 2). Важно отметить, что комплекс сохранялся при [NaCl] = 0,2 М, когдапроисходит разрушение всех солевых контактов пиридиниевых звеньев полимера сфосфатными группами КЛ2- [A.A.Yaroslavov et al., Colloids Surf. B, 16 (1999) 29-43].Что может быть причиной столь неожиданно высокой стабильности комплексаПБ3-липосома в водно-солевых средах? Как следует из Таблицы 1, ПБ3 и ПБ5 содержатзаметные количества немодифицированных пиридиновых колец. Их встраивание вгидрофобную часть липидного бислоя может приводить к дополнительной стабилизациикомплексов этих полимеров с липосомами.
Мы видели, однако, что соль полностьюубирает ПБ5 с липосомальной мембраны. Это означает, что немодифицированныепиридиновые звенья и другого полибетаина, ПБ3, не участвуют в дополнительнойстабилизации его комплекса с ФХ/КЛ2- липосомами.Известно, что шестичленные циклические структуры обладают повышеннойтермодинамической стабильностью. Бетаиновые группы в ПБ3 могут в принципеформировать подобные структуры за счет внутримолекулярных солевых связей, как этопоказано на Схеме 1.NNNH2CH2CH2CCH2NOH2CCH2COCOOСхема 1. Образование внутримолекулярных циклов в ПБ3.Образующиеся шестичленные циклы с взаимно нейтрализованными зарядамикарбоксилатной и пиридиниевой групп могли бы проникать в гидрофобную частьлипидного бислоя и тем самым стабилизировать комплекс ПБ3-липосома, делая егонечувствительным к концентрации соли в окружающем растворе.
В связи с этим стоитотметить, что формирование внутримолекулярных циклов должно понижать доступностьпиридиниевых групп и уменьшать их способность тушить флуоресценцию встроенной влипосомальную мембрану метки (по сравнению с ПБ2 и ПБ5). Последнее действительнонаблюдалось в эксперименте (ср. Рис. 2, кривую 3 с кривыми 2 и 4).10Встраиваниетаких достаточно объемныхзаместителей, какими являютсявнутримолекулярные шестичленные циклы в ПБ3, может сопровождаться формированиемдефектов в липидном бислое и повышением его проницаемости по отношению книзкомолекулярным ионам. Целостность липосомальной мембраны в контакте споликатионами контролировали методом кондуктометрии.
Для этого были приготовленыФХ/КЛ2- липосомы, внутренний водный объем которых был заполнен 1М раствором NaCl.Нарушениецелостностимембраныдолжнобылосопровождатьсяувеличениемэлектропроводности липосомальной суспензии. Полученный результат сравнивали сэлектропроводностью, полученной в ходе контрольного эксперимента – разрушениялипосом в присутствии избытка детергента (Тритона Х-100), которую принимали за 100%.ПридобавленииПБ3ксуспензиилипосомнаблюдалосьувеличениеэлектропроводности смеси на 13 % за 45 минут (Рис. 5, кривая 1), что свидетельствует опоявлении дефектов в липосомальной мембране, через которые происходило вытеканиесоливокружающийраствор.Напротив,добавлениедругого,обратимогоадсорбирующегося полибетаина, ПБ2, не вызывало увеличения электропроводностисистемы (Рис.
5, кривая 2), и указывало на сохранение целостности мембраны приРисунок5.Зависимостьотносительной31,0электропроводности0,8Ω/Ωмакссуспензии комплекса ПБ3-КЛ2-/ФХ10,6липосомы2(1),ПБ2-КЛ2-/ФХлипосомы (2) и суспензии липосом0,4после добавления детергента (3)0,2от времени. Общая концентрация0,0липидов 1 мг/мл, [ПБ2]=10-3 М,050100150.ним,ямерВОтносительная электропроводность, Ω/Ωmaxобразовании комплекса ПБ2-липосома.[ПБ3]=10-3 М, 10-2 М фосфатныйбуфер, рН 7,0.Ранее было показано, что адсорбция катионного полимера с высокой линейнойплотностью заряда (например, полилизина) на поверхности смешанных липосом,состоящих из анионного и нейтрального липидов, сопровождается микрофазовымразделением в липосомальной мембране [A.A.Yaroslavov et al., Acc.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
