Комплексы полиамфолитов с липидными мембранами - формирование, строение и свойства (1105584), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Доля цетильных групп в сополимерах варьировалась от0,03 до 0,13 с соответствующим понижением доли бетаиновых групп от 0,93 до 0,84.Как и ожидалось, добавление синтезированных ПБЦ сополимеров к суспензиифлуоресцентно меченых ФХ/КЛ2- липосом приводило к образованию комплекса ПБЦлипосома и уменьшению интенсивности флуоресценции метки (Рис. 10). Добавлениераствора NaCl к суспензиям полученных комплексов практически не влияло на16интенсивностьфлуоресценции:онасохраняласьнауровне,достигнутомприформировании комплексов ПБЦ-липосома (Рис. 11а). Таким образом, увеличениеконцентрациисолинеприводилокдиссоциациикомплексовлипосомсгидрофобизованными полиамфолитами.
Очевидно, дополнительная стабилизация такихкомплексов в водно-солевых средах достигалась за счет встраивания цетильныхрадикалов в гидрофобную часть липидного бислоя. Для сравнения на том же рисункеприведены данные для комплекса ФХ/КЛ2- липосом с полибетаином ПБ2 и катионнымПЭВП, которые, как было показано выше, полностью диссоциируют при повышенииконцентрации соли в окружающем растворе.Флуоресценция, о.е.1,0Рисунок10.относительной0,80,6меченных2концентрации ПБ2 (1), ПБЦ-1 (2),324682-КЛ /ФХлипосомотПБЦ-5 (3) и ПЭВП (4). Общаяконцентрация липидов 1 мг/мл, 10-2М фосфатный буфер, рН 7,040флуоресценции10,40,2Зависимость410[Полиэлектролит]*10 , МТакимобразом,ужесформированныйкомплексанионныхлипосомигидрофобизованного полиамфолита не разрушается при увеличении концентрации соли.А может ли комплекс формироваться при добавлении раствора полиамфолита к водносолевой суспензии липосом? Такая ситуация имитирует поведение полиамфолита вклеточной суспензии, содержащей значительные количества неорганических солей.Для ответа на этот вопрос 1 мг/мл суспензию меченых ФХ/КЛ2- липосомсмешивали с раствором NaCl разной концентрации и затем добавляли 7,5×10-4 М растворполиамфолита, ПБЦ-1 или ПБЦ-4.
Результаты представлены на Рис. 11б в видезависимости относительной интенсивности флуоресценции, установившейся в системе, отконцентрации NaCl. Видно, что при всех исследованных концентрациях соли ([NaCl] ≤ 0,3М) уровень флуоресценции равен примерно 50% от исходного (липосом в отсутствииполимера). Иными словами, оба полиамфолита с боковыми гидрофобными радикаламиобразовывали с анионными липосомами комплексы в водно-солевом растворе. Важно, что17для эффективного связывания полимера на поверхности липосом достаточно было ввестив макромолекулу 3 мол.
% цетильных боковых групп.1.01,030,8Флуоресценция, о.е.Флуоресценция, о.е.4210,60,40,20,00,00,10.80.6210.40.20.00.000,20.050.100.15[NaCl], М0.200.250.30[NaCl], МбаРисунок 11. Зависимость относительной флуоресценции комплекса полиэлектролит меченные КЛ2-/ФХ липосомы от концентрации NaCl. (а) Раствор соли добавляли краствору комплекса; [Полиэлектролит]= 2×10-4 М.
ПБЦ-1 (1), ПБЦ-4 (2), ПЭВП (3) и ПБ2(4).(б)Растворполимерадобавляликводно-солевойсуспензиилипосом;-4[Полиэлектролит]= 7,5 ×10 М. ПБЦ-1 (1), ПБЦ-4 (2). Общая концентрация липидов 1Полное разрушение липосом1,040,810,60,40,20,0010203040506070Время, мин.80Относительная электропроводность,Ω/ΩmaxОтносительная электропроводность,Ω/Ωmaxмг/мл, 0,01 М боратный буфер, рН 9.2.Полное разрушение липосом1,040,80,620,430,20,0020406080100120140Время, мин.абРисунок 12. Зависимость относительной электропроводности суспензии комплексаПБК-3-КЛ2-/ФХ липосомы (1, а), ПБЦ-1- КЛ2-/ФХ липосомы (2, б), ПБЦ-4- КЛ2-/ФХлипосомы (3, б) и суспензии липосом после добавления детергента (4 а, б) от времени.Общая концентрация липидов 1 мг/мл, [ПБК-3]=10-3 М, [ПБЦ-1]=10-3 М, [ПБЦ-4]=10-3М, 10-2 М фосфатный буфер, рН 7,0.18В заключение возникает вопрос: сохраняется ли целостность липосом после ихсвязывания с модифицированными полибетаинами, ПБК и ПБЦ? Для ответа на него былиспользован описанный выше подход: смешивали растворы полимеров (ПБК-3 из первойгруппы и ПБЦ-4 из второй группы) и ФХ/КЛ2- липосом, заполненных 1 М растворомNaCl,иследилизаэлектропроводностьюполученнойсуспензииспомощьюкондуктометрии (Рис.
12). Оказалось, что в обоих случаях электропроводность суспензиикомплекса не менялась по крайней мере в течение 1,5 часов, то есть целостность липосомв комплексе с полиамфолитами сохранялась.3. Цитотоксичность полиамфолитов.Для определения цитотоксичности полиамфолитов был использован методприжизненного окрашивания клеток метилтетразолевым синим. Проникший внутрьклеток краситель под действием окислительно-восстановительных ферментов окислялсядо формазана, который выпадал в виде темно-синих кристаллов. В погибших клеткахтакого превращения красителя не происходило.
Чем активнее происходили процессыжизнедеятельности в клетке, тем большее количество красителя в ней накапливалось.Долю выживших (т.е. продуцирующих формазан) клеток оценивали, измеряя оптическуюплотность при длине волны 550 нм, соответствовавшей максимуму поглощенияформазана.На Рис. 13а представлены зависимости доли выживших клеток линии MCF-7 отконцентрации добавленных полибетаинов (ПБn). Как следует из представленных нарисунке данных, для катионного полимера, ПЭВП (поли-N-этил-4-винилпиридинийбромида), концентрация, вызывавшая 50% гибель клеток (ЛД50), составляет примерно 10-4М.
Для полибетаинов с небольшой длиной развязки в бетаиновой группе (ПБ1 и ПБ2) ЛД50выше на два порядка, а для ПБ3 и ПБ5 на один порядок по сравнению с поликатионом, тоесть оба полимера обладают меньшей токсичностью, чем ПЭВП. Высокую токсичностькатионныхполимеровобычносвязываютсихспособностьюэффективновзаимодействовать с анионными компонентами клеточной мембраны (ферментами,рецепторами, каналообразователями и проч.), что сказывается на функционированииклетки и в конечном итоге может привести к ее гибели.
Можно предположить, чтоанионная группа, расположенная поблизости от катионной, уменьшает эффективностьсвязывания полимера с анионными компонентами мембраны и снижает токсичностьполимера.19Выживаемость клеток, %120100Рисунок13а.80Зависимость60выживаемости3,4401,2отконцентрацииполиэлектролита:20клетокПБ1(1), ПБ2 (2), ПБ3 (3), ПБ5501E-41E-34[Полиэлектролит]*10 , М0,01(4) и ПЭВП (5).КлеткиМCF 7.Выживаемость клеток, %120Рисунок10013б.Зависимость80выживаемости602от401полиэлектролита:204350клетокконцентрацииПБ2(1), ПБК-1 (2), ПБК-2 (3),ПБК-5 (4) и ПЭВП (5).Клетки МCF 7.1E-41E-3-40,01[Полиэлектролит]*10 , МВыживаемость клеток, %140120100Рисунок13в.Зависимость8060выживаемости клеток1от4020полиэлектролита: ПБ22,340концентрации(1), ПБЦ-1 (2), ПБЦ-4(3) ПЭВП (4). Клетки1E-41E-30,01-4[Полиэлектролит]*10 , М20МCF 7.Казалось бы, замена части бетаиновых групп на катионные (переход от ПБn к ПБК)должна приводить к увеличению токсичности полимеров.
Однако, как следует из данныхРис. 13б, полиамфолиты серии ПБК демонстрировали токсичность на 2 порядка меньшуюпо сравнению с токсичностью катионного ПЭВП. Причина низкой токсичности ПБК,особенно у полимеров с высоким содержанием катионных групп, остается пока неясной.Тем не менее, полученный результат показывает, что введение катионных групп вмолекулу полибетаина не оказывает влияния на токсичность полимера и при этомповышает устойчивость комплекса полимер-анионный липид в водно-солевых растворах(Рис.
9). Вместе с тем, даже при высоком содержании катионных групп в ПБКнаблюдается диссоциация комплекса в растворе с физиологической концентрации соли,[NaCl] = 0,15 М.Модификация полибетаина боковыми гидрофобными (цетильными) радикаламипозволяет сохранить характерный для полибетаинов низкий уровень цитотоксичности(Рис.
13в) и решить проблему стабилизации комплекса полимер-липидный бислой вприсутствии высоких концентраций соли. Введение в молекулу поолибетаина всего 3мол.% боковых цетильных групп полностью блокирует диссоциацию комплекса в 0,15 Мрастворе NaCl (Рис. 11).21ВЫВОДЫ1. Впервые путем модификации поли-4-винилпиридина ω-бромкарбоновымикислотами и бромистыми алкилами синтезированы три группы полиамфолитов: 1) скатионными и анионными группами в каждом звене (полибетаины, ПБn), 2) сбетаиновыми и катионными группами и 3) с бетаиновыми группами и боковымицетильными радикалами, и исследовано их комплексообразование с липосомами,сформированными из цвиттер-ионного (электронейтрального) фосфатидилхолина ианионного дифосфатидилглицерола (кардиолипина).2.
Установлено, что варьирование длины метиленовой развязки в бетаиновойгруппировке позволяет реализовать различные варианты поведения полибетаина всуспензиианионныхлипосом:ототсутствиявзаимодействиядозначительныхструктурных перестроек в липосомальной мембране (латеральной сегрегации итрансмембранной миграции липидов), вызванных адсорбцией полимера. Целостностьлипосом в комплексе с полиамфолитами сохраняется. Единственным исключениемявляется ПБ3, полученный модификацией поли-4-винилпиридина ω-бромпропионовойкислотой, который при связывании с липосомами формирует дефекты в липидном бислоеи повышает проницаемость липосомальной мембраны.3.
Показано, что стабильность комплексов полиамфолит-липосома в водно-солевыхсредах определяется строением полимерной молекулы. Комплексы, образованные ПБn илипосомами, полностью диссоциируют на составляющие компоненты в растворе сфизиологической концентрацией соли; введение в молекулу полибетаина боковыхцетильных радикалов стабилизирует его комплекс с липосомами в присутствии соли.4. Цитотоксичность синтезированных полиамфолитов на 1-2 порядка нижецитотоксичностихорошоизученногокатионногополимера,винилпиридиний бромида (ПЭВП), той же степени полимеризации.22поли-N-этил-4-Основные результаты диссертационной работы изложены в следующихпубликациях:1.A.A.Yaroslavov, T.A.Sitnikova, A.A.Rakhnyanskaya, Yu.D.Ermakov, T.V.Burova,V.Ya.Grinberg, F.M.Menger.
Contrasting behavior of zwitterionic and cationic polymer boundto anionic liposomes. // Langmuir. 2007. V. 23. P. 7539-7544.2.A.A.Yaroslavov, T.A.Sitnikova, A.A.Rakhnyanskaya, E.G.Yaroslavova, D.A.Davydov,T.V.Burova, V.Ya.Grinberg, Lei Shi, F.M.Menger, Biomembrane sensitivity to structuralchanges in bound polymers. // J. Am. Chem.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
