Автореферат (1105150), страница 4
Текст из файла (страница 4)
При этом плоскость эритроцитарного диска содержит ось распространения лазерного излучения. На рисунке 7а приведенымикрофотографии, отражающие динамику захвата эритроцита, снятые с промежуткомв 2 десятые секунды. В оптической ловушке эритроцит практически не изменяет своюформу, а только разворачивается.Рис. 8: a) Смещение края эритроцита из первой лоРис. 7: Микрофотографии эритроцитов в установке оптического пинцета.а) Динамика “захвата” эритроцита воптическую ловушку.
Микрофотографии сняты в интервалов в 0,2 с. б) Искусственно собранный агрегат эритроцитов.вушки при действии на него со стороны второй ловушкой силой Ftrap . На вставке показана схема проводимого эксперимента, dx — смещение края эритроцита из первой ловушки, dl — удлинение эритроцита,Fesc — максимальная сила, развиваемая при выбранной мощности лазерного излучения второй ловушки.б) Зависимость растяжения эритроцита под действием силы со стороны ловушек Ftrap . Сплошные линиисоответствуют линейным аппроксимациям участковзависимостей до 15 пН.Для определения каких-либо количественных параметров необходимо знать силу захвата эритроцита в оптическую ловушку. Для этого был проведен следующий экспери-11мент. В одну ловушку оптического пинцета в плазме крови захватывали эритроцит нарасстоянии 10 мкм от поверхности, а в другую полистироловую микрочастицу диаметром3 мкм, покрытую карбоксильными группами.
Меняя расстояния между оптическими ловушками эритроцит и частицу соединяли вместе. Через 1–2 минуты частица необратимоприклеивалась к эритроциту. Уравновешивали силу, развиваемую ловушками с краемэритроцита и с полистироловой микрочастицей. Максимальная сила захвата микрочастицы в совою очередь определялась по силе вязкого трения в среде с известным коэффициентом динамической вязкости.
Зная максимальную силу оптического “захвата”края эритроцита можно провести исследование эластичных свойств эритроцита.На рисунке 8б представлена зависимость растяжения эритроцита при различных силах прикладываемых к клетке, полученная с помощью обработки изображения растянутого эритроцита. Каждая точка получена усреднением по 10 экспериментальным реализациям. При силах до 15 пН это удлинение можно аппроксимировать линейным закономс коэффициентом пропорциональности K = 13 ± 2 пН/мкм.
Во время эксперимента также регистрировалось максимальное смещения края эритроцита из первой ловушки dx.Можно определить эффективную жесткость самой оптической ловушки, то есть силудействующую на край эритроцита при смещении его из центра ловушки на единицу смещения. Для малых смещений сила оказалась пропорциональна смещению с к коэффициентом k = 9 ± 1 пН/мкм. Таким образом получена жесткость ловушек и коэффициентупругости самого эритроцита в стационаром режиме. Есть актуальная задача динамического измерения упругих характеристик клеток.
Например, детектирования измененияэтих характеристик во времени, при действии различных веществ. Для решения этойзадачи удобно эритроцит рассматривать как колебательную систему. Из анализа отклика этой системы на внешнее периодическое воздействие можно определить эластичныесвойства системы.В эксперименте одиночный эритроцит плазме крови захватывался одновременно двумя оптическими ловушками за противоположные края клетки, как это схематично показано на рисунке 9a. Мощность инфракрасных лазеров в образце была 20 мВт для каждойиз ловушек, что достаточно для эффективного “захвата”, но в тоже время не оказываетсущественного воздействия оптической ловушки на эритроцит, связанного с нагревомклетки [14]. Затем с помощью акусто-оптического дефлектора положение первой ловушки приводилось в периодическое движение по гармоническому закону вдоль линии,соединяющей центры ловушек.
Положение же второй ловушки оставалось постоянным.Амплитуда смещений первой ловушки была 100 нм, частота — в диапазоне от 50 Гц до1 кГц. Это вызывало осцилляции клетки и, в частности смещение ее краев. Лазеры с длинами волн излучения в вакууме 670 и 635 нм и мощностью менее 0,2 мВт каждый былисфокусированы на края клеток, а рассеянное излучение собиралось на чувствительнуюповерхность квадрантных фотодиодов. В эксперименте оказалось, что края эритроцитасоздают контрастные изображения на соответствующих квадрантных фотодиодах, чтодает возможность с хорошей точностью определять фазу их движения относительно периодического смещения положения ловушки.Фаза колебаний края эритроцита φ в неподвижной ловушке относительно колебанийв осциллирующей была измерена как функция от частоты колебаний ловушки ω.
Нарисунке 10 показаны типичные зависимости тангенса этой фазы. Экспериментальныерезультаты показывают, что тангенс относительной фазы колебаний краев эритроцита пропорциональна частоте осцилляций ловушки в диапазоне от 50 Гц до 1 кГц. При12Рис. 9: a) Одиночный эритроцит, находящийся в двух независимых оптических ловушках; б) Феноменологическая механическая модель эритроцитав двух оптических ловушках, k — эффективная жесткость оптических ловушек, K — коэффициент эластичности эритроцита, γ и Γ — эффективныекоэффициенты вязкости системы.Рис. 10: Зависимость тангенса фазы колебаний краяэритроцита в неподвижной ловушке относительнокрая в осциллирующей ловушке от частоты осцилляций.
Не закрашенные точки соответствуют нормальным эритроцитам, а закрашенные относятся кэритроцитам, фиксированным глутаровым альдегидом. Сплошные линии — линейные аппроксимациисоответствующих зависимостейэтом наклон этой зависимости тангенса зависит от состояния мембраны эритроцита. Вчастности обычным эритроцитам плазме крови, которым на графике (рис. 10) соответствуют незакрашенные точки, этот наклон равен (−6.4 ± 0.1) · 10−4 с. Закрашенные жеточки соответствуют клеткам предварительно фиксированным путем добавления в образец 2,5% глутарового альдегида, который увеличивает жесткость клетки, связываятрансмембранные белки мембраны.
Наклон кривой для зафиксированных эритроцитовоказался равным (−2.7 ± 0.2) · 10−4 с.Для объяснения линейной зависимости была рассмотрена феноменологическая механическая модель эритроцита, отраженная на рис. 9б. Жесткости оптических ловушек kи эритроцита K представлены пружинами. Поршнями в модели отражены эффективныекоэффициенты вязкого трения γ и Γ модельной системы локализованного в две ловушки эритроцита. Показано, что в рассматриваемом диапазоне частот осцилляций второйловушки эта модель дает следующее выражение для тангенса разности фаз колебанийкраев эритроцита:Γk − γKtan φ = −ω = −ωτ.(4)k(k + K)Коэффициент пропорциональности τ определяет вязко-упругие характеристики “захваченной” в оптическом пинцете биологической клетки, как сложной гидродинамической системы. Коэффициент τ имеет размерность времени, поэтому его можно рассматривать как некое время отклика, связанного с характерным временем распространениямеханического возмущения в клетке.
Экспериментальные данные показывают, что дляфиксированного глутаровым альдегидом эритроцита это время сокращается с 640 до270 мкс, указывая на существенные изменения состояния клетки. Таким образом вели-13чина τ может быть использована для контроля эффективной жесткости клетки.Часть диссертационной работы посвящена определению агрегационных свойств эритроцитов. Для наблюдения процесса агрегации эритроцитов проводился следующий эксперимент. Два одиночных эритроцита захватывались в две оптические ловушки на некотором расстоянии друг от друга в аутологичной плазме.
Затем, двигая одну из ловушек,эритроциты сближались до касания. После чего лазерные пучки выключались. Клеткиагрегировали самостоятельно, образуя двойной агрегат. Если к полученному агрегатуподнести еще одну клетку, то она также прилипнет, и образуется агрегат из трех клеток и т.д. На рисунке 7б показана микрофотография искусственно собранного методомоптического пинцета агрегата эритроцитов.Измерения силового взаимодействия клеток проводились с использованием толькоискусственно полученных двойных агрегатов.
Для реализации процесса дезагрегацииловушки подводились к краям агрегата и раздвигались в противоположные стороны соскоростью около 0,3 мкм/с, разъединяя эритроциты. При этом в процессе проведенияэкспериментов в зависимости от мощности лазерного излучения в оптических ловушках,клетки удавалось либо растащить до конечной области соприкосновения эритроцитарных дисков, либо разделить. Обычно с увеличением мощности эритроциты из агрегатовудавалось сдвинуть друг относительно друга на все большее расстояние. В используемомдиапазоне мощностей излучения в ловушках до 20 мВт из проведенных 85 экспериментальных реализаций только в 8 случаях (9%) наблюдалось разделение агрегата на двеотдельные клетки.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
