Оксид азота и его физиологические комплексы в системах, моделирующих карбонильный стресс и их динамику в организме (1104205), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Всереакционные смеси содержали 150 мМ Na-фосфатный буфер (рН 7,2). Спектры ЭПРрегистрировались через 8 мин инкубации при постоянной продувке азотом.Этот сигнал, имеющий хорошо разрешённую сверхтонкую структуру из семикомпонент, возникает также при добавлении фосфатных ДНКЖ в реакционнуюсреду, содержащую цистеин и метилглиоксаль (рис. 5, спектр с). Новый сигнал, как и13спектры ЭПР исходных динитрозильных комплесов, исчезает в присутствиихелатора железа – батофенантролина (рис. 5, спектр d). Эти факты указывают наобразование нового типа динитрозильных комплексов железа (ДНКЖ-цис/МГ).
В тоже время при взаимодействии с метилглиоксалем глутатионовых ДНКЖ снижаетсяинтенсивность сигнала ЭПР, характерного для комплексов с тиольными лигандами,но сигналы нового типа не возникают. Существенно, что при добавлении фосфатныхДНКЖ к реакционной среде, содержащей метилглиоксаль и N-ацетилцистеин, такжене происходит образования нового типа ДНКЖ. Таким образом, модификацияаминогруппы цистеина предотвращает образование входящих в состав ДНКЖцис/МГ лигандов.
Представляется вероятным, что такими лигандами могут бытьоснования Шиффа, образующиеся в реакции карбонильных групп метилглиоксаля сα−аминогруппой цистеина. Известно, что основания Шиффа могут участвовать вформировании комплексов металлов переменной валентности. Взаимодействиеметилглиоксаля с тиольными лигандами ДНКЖ может быть затруднено, так какатомы серы в этих комплексах образуют координационные связи с ионом железа.Тем не менее, эффективно модифицирующий SH-группы агент - N-этилмалеимид(NEM)предотвращаетобразованиеДНКЖ-цис/МГвреакционнойсмеси,содержащей метилглиоксаль и цистеиновые ДНКЖ (рис.
6, спектр 1). При этом, поддействием NEM, цистеиновые ДНКЖ превращаются в фосфатные динитрозильныекомплексы (рис. 6, спектры 1, 2).Рис. 6. (1) - 1,8 мМ цистеиновых ДНКЖ +24 мМ NEM + 48 мМ метилглиоксаля;(2) - 1,8 мМ цистеиновых ДНКЖ + 24 мМ NEM;(3) - 1,8 мМ цистеиновых ДНКЖ +48 мМ метилглиоксаля, после 5 мининкубации добавлены 24 мМ NEM;(4) - 1,8 мМ глутатионовых ДНКЖ + 24 мМ NEM;(5) - 1,8 мМ глутатионовых ДНКЖ + 48 мМметилглиоксаля, после 5 мин инкубациидобавлены 24 мМ NEM.Все реакционные смеси содержали 100 мМNa-фосфатном буфер (рН 7,2). Спектры ЭПРрегистрировались через 8 мин инкубации припостоянной продувке азотом.12345319320321322323324М а гн и т н о е п о л е , м Т л14325В то же время добавление NEM после инкубации цистеиновых ДНКЖ сметилглиоксалем не влияет на образование ДНКЖ-цис/МГ (рис.
6, спектр 3). Такимобразом, ковалентная модификация тиольных групп N-этилмалеимидом разрушаетцистеиновые ДНКЖ, но не новый тип динитрозильных комплексов железа. Эти фактысвидетельствуют, что и образование гемитиоацеталя, в ходе реакции метилглиоксаля сSH-группой цистеина, необходимо для формирования ДНКЖ-цис/МГ. Следуетотметить, что фосфатные ДНКЖ образуются и при взаимодействии NEM сглутатионовыми ДНКЖ, но их концентрация существенно меньше (приблизительно в7 раз), чем в случае с цистеиновыми комплексами. Интересно, что образованиефосфатных ДНКЖ в этих условиях не зависит от присутствия метилглиоксаля (рис. 6,спектры 4, 5). Исходя из этого, можно предположить, что сера глутатионовыхлигандов ДНКЖ, в отличии от цистеиновых лигандов, менее доступна модификацииNEM.
На рис. 7 представлены спектры ЭПР цистеиновых ДНКЖ и ДНКЖ-цис/МГ,зарегистрированные при температуре жидкого азота. По литературным данным,форма низкотемпературного спектра ЭПР ДНКЖ-цис/МГ, характерна для комплексов,имеющих октаэдрическуюпространственнуюструктуру, в отличии от ромбической структуры,характерной для ДНКЖ с цистеиновыми иaглутатионовыми лигандами.Рис. 7. Спектры ЭПР при температуре жидкогоазота.а - цистеиновые ДНКЖ;б - производных цистеиновых ДНКЖ сметилглиоксалем (ДНКЖ-цис/МГ).бCигнал ЭПР с g фактором равным 2,018 такжевозникает в реакционной смеси, содержащей лизин,метилглиоксаль,фосфатныеДНКЖили320324328332336340Магнитное поле, мТлсинтетические доноры оксида азота (DETA/NO, PAPA/NO) в сочетании с ионами Fe2+ (рис.8).
Видно, что спектр ЭПР динитрозильных комплексов железа (ДНКЖ-лиз/МГ),возникающих при взаимодействии метилглиоксаля с лизином, имеет менее разрешенную15структуру. В то же время сигналы ЭПР ДНКЖ-лиз/МГ не регистрируются при заменелизина на N-ацетиллизин. Таким образом, α−аминогруппа лизина аналогично ДНКЖцис/МГ необходима для образования входящего в состав ДНКЖ-лиз/МГ лиганда. Скореевсего, в координации ионов железа в этих комплексах участвует азот основания Шиффа иα−карбоксильная группа аминокислоты.g = 2 ,0 1 8Рис.8.СпектрыЭПРДНКЖ,зарегистрированные через 5 мин последобавленияксмесилизинасметилглиоксалем доноров оксида азота.(1) - реакционная смесь + 0,5 мМ фосфатныхДНКЖ;(2) - реакционная смесь + 7,5 мМ DETA/NO.В последнем случае в реакционную смесьтакже добавляли 0,5 мМ FeSO4.Существенно,аэрациичтореакционнойвусловияхсредыДНКЖ-12315320325330М а гн и тн о е п о л е , м Т ллиз/МГ быстро разрушается, при этомскорость деструкции этого комплекса уменьшается в присутствии СОД (рис.
9). Этотфакт согласуется с полученными нами данными о интенсивной генерациисупероксидавходевзаимодействияаэрациялизина с метилглиоксалем.1,2Рис. 9. Кинетика деструкции ДНКЖлиз/МГ в условиях аэрации.(1) - в присутствии СОД (600 ед./мл);(2) - без добавок.Сигнал ЭПР, отн.ед.1,00,810,60,40,220,021646810Время, мин1214Вшестойглаве,вразделе6.1описановзаимодействиенизкомолекулярных динитрозильных комплексов железа с компонентами кровиживотных.
Предполагается, что одной из основных функций ДНКЖ в организмеживотных является транспорт оксида азота в кровеносной системе. В связи сэтим,представлялонесомненныйинтересисследованиевзаимодействиянизкомолекулярных ДНКЖ с компонентами крови. С этой целью цистеиновыеДНКЖ и их производные с метилглиоксалем добавлялись в образцыгепаринизированной крови, отобранные у экспериментальных животных. Вконтроле ДНКЖ добавлялись в физиологический раствор.Рис.
10. Введение цистеиновых ДНКЖ вцельную кровь.1 - ДНКЖ в физиологическом растворе(отношение железа к цистеину 1:20);2 - крысиная кровь + ДНКЖ;3 - плазма (кровь после добавления ДНКЖинкубировали в течении 7 мин. и далеефракционировали);4 - эритроцитарная масса (из крови,содержавшей ДНКЖ) ресуспензированая вфизиологическом растворе.В цельной крови и плазме цистеиновыеДНКЖ (спектр 1) полностью переходят набелковые компоненты, при этом возникаетсигнал, характерный для белковых ДНКЖ с1Модуляция 2 Гс24 Гс34 Гс44 Гс316320324328Магнитное поле, мТлаксиальной симметрией (спектры 2 и 3), вкоторых железо связано с двумя тиольными лигандами. Введение в образцы цельнойкрови ДНКЖ-цис/МГ, также приводит к образованию белковых ДНКЖ (рис. 11,спектр 2).
Однако, эти ДНКЖ имеют ромбическую симметрию. Более низкаясимметрия этих комплексов обусловлена тем, что железо в них координированоразными лигандами, вероятно, цистеином и гистидином. Известно, что такиесигналы характерны для ДНКЖ, связанных с альбумином.Таким образом, более низкая симметрия белковых комплексов, возникающих вцельной крови и плазме, под действием ДНКЖ-цис/МГ, подтверждает, что в составе17последних нет свободных тиольных групп.
В то же время следует отметить что какцистеиновыеДНКЖ,такиДНКЖ-цис/МГневызываютобразованиядинитрозильных комплексов, связанных с эритроцитами.Рис. 11. Введение ДНКЖ-цис/МГ вцельную кровь. ДНКЖ-цис/МГ полученыпри обработке метилглиоксалемцистеиновых ДНКЖ (1:20).1 - ДНКЖ-цис/МГ в физиологическомрастворе;2 - крысиная кровь + ДНКЖ-цис/МГ;3 - плазма (кровь после добавления ДНКЖинкубировали в течении 7 мин.
и далеефракционировали);4 - эритроцитарная масса (из крови,содержавшей ДНКЖ) ресуспензированая вфизиологическом растворе.М од ул яц и я 2 Гс124 Гс34 Гс44 ГсВ разделе 6.2 описано исследованиеизбирательного мониторинга уровня NO3163 203 2432 8М а гн и тн о е п о л е , м Т лв тканях важнейших органов в контроле,и его изменение в результате 30-минутной ингаляции воздухом с повышеннымсодержанием NO. Работа проводилась методом ЭПР с применением в качествеспиновойловушкиNOлипофильныхкомплексовионовжелезаидиэтилдитиокарбамата (Fe3+-DETC3), способных формироваться и накапливатьсяв гидрофобных компонентах клеток органов. Известно, что такие комплексыспособныэффективнообразованиемвзаимодействоватьпарамагнитныхаддуктовснизкомолекулярнымNO-Fe2+-DETC2.NOПоэтомусдлярегистрации уровня NO проводилось исследование образцов ткани органовживотных с включённой в них спиновой ловушкой.На рис.
12 представлены полученные при температуре жидкого азотахарактерные спектры ЭПР образцов ткани органов крыс из контрольной группыв области g=2,04. Из этого рисунка видно, что во всех спектрах регистрируетсятриплет из узких эквидистантных линий в области g=2,04 (компоненты e, f, j).Этот триплетный сигнал отражает появление в образцах квазистабильных18парамагнитныхаддуктовNO-Fe2+-DETC2,образующихсяврезультатевзаимодействия молекул ловушки и короткоживущего радикала оксида азота.aРис. 12. Спектры ЭПРобразцов замороженнойткани органов крыс изконтрольной группы.1 – сердце, 2 – лёгкое,3 – печень, 4 – почка,5 – скелетная мышца.Температура – жидкийазот.befdcj12I1345320325330335340Для количественных оценок уровня NO в ткани исследуемых органов для всехобразцов рассчитывали амплитуду высокопольной компоненты спектра ЭПР этогоаддукта (I1, рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
