Оксид азота и его физиологические комплексы в системах, моделирующих карбонильный стресс и их динамику в организме (1104205), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Целью обзора литературы было не только показатьсовременное представление о разделе биофизики, посвященном свободнымрадикалам кислорода и азота, но и показать место данной работы в этом разделе,обосновать актуальность поставленных в ней задач.Во второй главе представлены материалы и методы исследования. В разделе2.1 перечислены препараты, используемые в работе, описывается их получение.Раздел 2.2 посвящен регистрации спектров ЭПР и регистрации образованиясупероксидного радикала при моделировании карбонильного стресса.
СпектрыЭПР регистрировали на спектрометре E-109Е фирмы Varian (США). Условиярегистрации спектров ЭПР: СВЧ мощность 5 мВт, СВ частота 9,15 ГГц, амплитудаВЧ модуляции 0,05 мТл для TIRON и СВЧ мощность 10 мВт, амплитуда ВЧмодуляции 0,4 мТл для ДНКЖ. Спектры феноксильного радикала пробукола7регистрировали при СВЧ мощности 50 мВт. В экспериментах по моделированиюкарбонильного стресса генерирование супероксидного анион-радикала (О2•−)регистрировали по восстановлению супероксидом нитросинего тетразолия(НСТ).
Кинетику накопления продукта восстановления НСТ - формазанаопределяли по поглощению при 560 нм на спектрофотомере Hitachi-557(Япония) при температуре 25о. Реакцию инициировали добавлением 10 мМметилглиоксаля или 10 мМ МДА к среде, содержащей 100 мкМ нитросинеготетразолия и 10 мМ L-лизина в 100 мМ карбонатном буфере pH 9,5.В разделе 2.3 описывается методика исследования уровня оксида азота втканях органов крыс после ингаляции воздухом с повышенным содержанием NO иинъекциипрепаратадинитрозильныхкомплексовжелезасглутатионом.Эксперименты проводились на крысах Wistar. Уровень оксида азота в тканяхопределяли с помощью спиновой ловушки, компоненты которой вводилисьживотным путеминъекций: диэтилдитиокарбамат (DETC, 620 мг/кг в 1,0 млфизиологического раствора, внутрибрюшинно) и FeSO4•7H2O с цитратом Na (25 и125 мг/кг, соответственно, в 1,0 мл физиологического раствора, подкожно в областьлевого плеча).
По окончанию физиологической части эксперимента, животныхзабивали и экстрагировали органы. Изолированные органы промывали вфизиологическом растворе, после чего их измельчали и помещали в пластиковыетрубки диаметром 5,0 мм, замораживали и хранили в жидком азоте. Спектры ЭПРвсех образцов регистрировали при температуре жидкого азота. Амплитудамодуляции магнитного поля составляла 0,2 мТл при частоте 100 кГц. Частота СВЧполя составляла 9,32 ГГц, а её мощность во всех случаях устанавливалась на уровне10 мВт. Раздел 2.4 посвящен описанию получения изолированных митохондрий иопределению их функциональной активности. Митохондрии выделяли из сердецкрыс.
Животных усыпляли, используя 20% раствор уретана (1,8 мг/кг массыживотного). Затем быстро извлекали сердце и помещали в охлажденную (4οС)среду выделения. Состав среды выделения: 300 мM сахароза, 10 мM HEPES (N-2гидроксиэтилпиперазин-N-2-этансульфоноваякислота),0,5мMEDTA(этилендиаминтетрауксусная кислота); рН 7.4. Измельченную ткань переносили вгомогенизатор (стекло-тефлон), добавляли 25-30 мл среды выделения в8соответствии с соотношением 1:8 и гомогенизировали 2-3 минуты до превращениясуспензии в гомогенную. Осаждение митохондрий производили в два этапа нацентрифуге К-24 (ГДР).
Полученный осадок митохондрий суспензировали в 150 млБСА. Далее помещали в маленькую пробирку и хранили во льду или замораживалипри –20°С. Концентрация белка в митохондриальной суспензии, определенная побиуретовому методу, составляла 30-35 мг/мл.В третьей и последующих главах представлены результаты исследований.Третья глава посвящена изучению антиоксидантных свойств ДНКЖ в различныхмодельных системах. В качестве источника О2•- использовались митохондрии, вкоторых генерация супероксида индуцировалась антимицином А.
Образование О2•- вэтих условияхфиксировалось с помощью спиновой ловушки TIRON. На рис. 1показана деструкция глутатионовых ДНКЖ при их инкубации с митохондриями изсердечной мышцы крыс в присутствии сукцината, в качестве субстрата, и антимицинаА. При добавлении в систему супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы скорость распадаДНКЖ значительно снижалась. Этот факт указывает на то, что деструкцию ДНКЖвызываетименноО2•-,генерируемый1000дыхательной цепью митохондрий.Рис. 1. Деструкция ДНКЖ при генерацииО2•- митохондриями из сердца крысы.(1) – инкубационная среда + 0,2 мМДНКЖ + 1 мкг/мл антимицина А + 5 мМсукцината;(2) − то же что и (1) + СОД (150 ед/мл) +каталаза (400 ед/мл).КромесупероксидаокислительногострессаввразвитииорганизмеСигнал ЭПР, отн.
ед.80026004001200004812Время, мин16человека и животных участвуют и другиесоединения. Известно, что гемопротеиды стимулируют процессы перекисногоокисления. В связи с этим, антиоксидантное действие ДНКЖ оценивалось поингибированию образования в системе гемин/H2O2 феноксильного радикалапробукола.
Последний является синтетическим антиоксидантом близким по9структуре и механизму действия к α-токоферолу. Из рис. 2 видно, что ДНКЖ как сглутатионовыми так и с цистеиновыми лигандами, в молярных соотношенияхсравнимых с H2O2 и гемином, более чем на 70% ингибируют образование радикалапробукола. Динитрозильные комплексы с фосфатными лигандами несколько менееэффективны (~50% ингибирования). Из этого следует, что тиольные лиганды, как иNO, вносят вклад в снижение концентрации радикала пробукола. Представляетсявероятным, что активные окислители, образующиеся при взаимодействии гемина сH2O2 (оксоферрилформа гемина или гидроксильный радикал), перехватываются инейтрализуются динитрозильными комплексами.Рис.
2. Влияние ДНКЖ с различнымилигандами на образование радикалапробукола. Реакционная смесь содержала:изопропанол/K,Na-фосфатный буфер, 1,5мМ пробукола и 0,25 мМ гемина.1 − спектр ЭПР феноксильного радикалапробукола,образовавшегосяпоследобавления в реакционную среду 2 мМН2О2;2 − то же что и (1) + 0,5 мМ ДНКЖ,содержащих цистеин;3 − то же что и (1) + 0,5 мМ ДНКЖ,содержащих глутатион;4 − то же что и (1) + 0,5 мМ ДНКЖ сфосфат-анионом в качестве лиганда.Приведенныевышеg = 2 ,0 0 31234324325326327328329М а гн и т н о е п о л е , м Т лмодельныесистемы касались в первую очередь низкомолекулярных динитрозильных комплексов.Но в литературе уже давно обсуждается вопрос о возможной роли и функциях Sнитрозотиолов и динитрозильных комплексов, связанных с белками.
Такая уникальнаямолекула, как гемоглобин способна связывать NO тремя разными способами. Оксидазота нитрозилирует гем (Fe2+-NO), может входить в состав S-нитрозогемоглобина(белковый S-нитрозотиол) и, наконец, по цистеиновым остаткам может формироватьсяассоциированный с гемоглобином динитрозильный комплекс железа (Hb-ДНКЖ). Этоткомплекс имеет характерный спектр ЭПР (рис. 3, спектр 1). Для понимания ролисупероксида и роли таких интермедиатов окислительного стресса как органические10гидропероксиды в метаболизме этого типа ДНКЖ, исследовалось взаимодействиегемоглобиновых ДНКЖ с O2•– и гидропероксидом трет-бутила. Как видно из рис.
3, привзаимодействии гемоглобинового ДНКЖ с гидропероксидом трет-бутила происходитзависимаяотдеструкциягидрофильныйконцентрацииHb-ДНКЖ.последнегоПриантиоксидант–этомаскорбат1защищает эти комплексы.Рис. 3. Деструкция гемоглобиновых ДНКЖ поддействием гидропероксида трет-бутила; (1) - HbДНКЖ, получаемые при смешивании 0,3 мMфосфатных ДНКЖ с 20 мM Hb в 2 М Naфосфатном буфере (2,5 мин. инкубации);(2) - (1) + 0,2 мM t-BOOH; (3) - (1) + 0,4 мM tBOOH; (4) - после t-BOOH добавлен аскорбат 8 мM.234310315320325330Вероятнее всего деградация Hb-ДНКЖпроисходит в результате образования оксофериллформы гемоглобина и перекисногорадикала трет-бутила.Четвертая глава посвящена изучению окислительной модификации белков идругих биомолекул при карбонильном стрессе. В качестве модели былаиспользована система взаимодействия L-лизина и метилглиоксаля. В результатетакоговзаимодействияванаэробныхусловияхпроисходитобразованиесвободнорадикальных интермедиатов, регистрирующихся методом ЭПР.
Их спектримеет многокомпонентную сверхтонкую структуру и, по литературным данным,является суперпозицией спектров анион-радикала метилглиоксаля (МГ•−) и катионрадикала диалкилимина. На рис. 4 представлены последовательности реакций,приводящие к образованию свободных радикалов при взаимодействии аминокислотс карбонильными соединениями.
Видно, что диалкилимин представляет собойоснование Шиффа (имин), возникающее в процессе взаимодействия карбонильныхгрупп метилглиоксаля с двумя молекулами L-лизина. В реакции диалкилимина с ещёодной молекулой α-кетоальдегида образуются, соответственно, катион-радикалоснования Шиффа и семидион метилглиоксаля (МГ•−).11лизин2 H 2 N C H(R)C O O-метил глиоксаль+H3COHH3COH3C-O O C(R)H C Nпродукты конечногогликированияанион-радикалметил глиоксаляO-.HOH3CH-O O C(R)H C NN C H(R)C O O-+.HN C H(R)C O O-катион-радикал д иалкилим инаметилглиоксалядиал килимин метил глиоксаляРис.
4. Схема возможных реакций L-лизина с метилглиоксалем.Важно отметить, что в условиях аэрации реакционной смеси намизарегистрированы лишь следовые количества свободнорадикальных интермедиатов.Замена газовой среды на азот после инкубации смеси метилглиоксаля с L-лизином ваэробных условиях приводит к значительному (почти на порядок) росту уровнясвободныхрадикалов,предположительнодиалкилиминаиметилглиоксаля.Существенно, что в этих условиях содержание свободнорадикальных интермедиатоввозрастало при добавлении СОД к реакционной смеси. Вызываемый СОД эффектсвязан с тем, что этот фермент удаляет супероксидный радикал, генерируемый висследуемой модельной системе. В работе показано, что О2•− интенсивно генерируетсяпри взаимодействии L-лизина с метилглиоксалем в карбонатном буфере рН 9,5.Оценку образования супероксида проводили по накоплению формазана привосстановлении НСТ.
Исходя из того, что СОД значительно (более чем в 4 раза)подавляла образование формазана в описанных условиях, можно утверждать, чтобольшая часть НСТ восстанавливается под действием О2•−. Снижение концентрациирегистрируемых методом ЭПР свободных радикалов в аэрируемой реакционнойсреде, вероятно,не связано с ингибированием их образования. Представляетсявероятным, что свободно-радикальные интермедиаты непосредственно реагируют скислородом, в следствии чего образуются нерадикальные продукты и супероксид.МГ•−+ О2 → МГ + О2•−(1)Диалкилимин•+ + О2 → Диалкилимин+2 (дикатион) + О2•−(2)Таким образом, вероятно, что окислительная модификация белков и другихбиомолекул может быть следствием12локального генерирования О2•− привзаимодействии остатков L-лизина (и, по-видимому, других аминокислот) с αкетоальдегидами.
Этот феномен неферментативного генерирования супероксидаможет быть элементом автокаталитического усиления патофизиологическогодействия карбонильного стресса.В пятой главе описывается образование новых типов ДНКЖ, связанных спродуктами реакции метилглиоксаля с цистеином и L-лизином. В присутствииизбытка метилглиоксаля в реакционной среде, содержащей фосфатный буфер ицистеиновые ДНКЖ, исчезает характерный для этих комплексов спектр ЭПР с gфактором равным 2,03 (рис. 5, спектр a), но появляется сигнал фосфатных ДНКЖ иновый сигнал ЭПР с g фактором равным 2,018 (рис. 5, спектр b).g = 2 ,0 1 8g = 2 ,0 3бacд3183203223243 2 6 31 8М а гн и тн о е п о л е , м Т л3203223 24М а гн и тн о е п о л е , м Т л326Рис. 5. Спектры ЭПР различных типов ДНКЖ. (a) - 3,6 мМ цистеиновых ДНКЖ;(b) - 100 мМ метилглиоксаля + 3,6 мМ цистеиновых ДНКЖ; (c) - 50 мМцистеина + 150 мМ метилглиоксаля, после 5 мин инкубации добавленыфосфатные ДНКЖ; (d) – то же что и (b) + 1,5 мМ батофенантролина.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
