Диссертация (1103763), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Посколькумикротрубочка до наступления катастрофы медленно растет, а потом очень быстроукорачивается, то типичная кимограмма одного события катастрофы будет иметь вид какна Рис. 5. Далее по таким кимограммам измерялись времена жизни микротрубочек –время с момента начала роста до наступления катастрофы.18Рис. 5. Кимограмма, иллюстрирующая одно событие катастрофы микротрубочки in vitro [44]. Погоризонтальной оси отложено расстояние, по вертикальной – время.
Красным показана стабильная«затравка» - короткий кусочек микротрубочки, выращенный в присутствии негидролизуемогоаналога ГТФ – GMPCPP. Зеленым показано тело микротрубочки. Изображения получены спомощью флуоресцентной микроскопии.Эти эксперименты показали, что распределение длины микротрубочки в моментнаступления катастрофы, так же как и времени с момента начала роста до наступлениякатастрофы, имело неожиданный вид (Рис. 6).Рис. 6.
Распределение длины микротрубочек в момент наступления катастрофы. Рисунок из статьиГарднер и соавторы 2011 года [44].Вместопредполагаемогоэкспоненциальногораспределения,соответствующего19описываемому реакцией первого порядка событию, были получены распределения спиком. Видно, что аппроксимация распределения с помощью экспоненциальнойзависимости не сможет описать начальный участок, где почти не было катастроф. Прямойпересчет распределения времен жизни микротрубочки в частоты катастроф даетрастущую зависимость частоты катастроф со временем (см. Рис.
7), что и принятоназывать феноменом «старения» микротрубочек.Рис. 7. Зависимость частоты катастроф от времени, полученная в эксперименте in vitro[44]. Точкидля данной зависимости были рассчитаны по формуле Y=(f(t))/(1-F(t)), где F(t) - это интегральноераспределение времен жизни микротрубочки, f(t) – функция плотности вероятности наступлениякатастрофы (первая производная от F(t)).Красная линия показывает, как выглядела бызависимость при отсутствии «старения».Задержка во времени до наступления катастрофы у «молодых» микротрубочек говорит отом,чтоэтотдифференциальноепроцессноситмногостадийныйраспределение,характерхарактеризующее[43].Известно,одностадийныйчтопроцесс,подчиняется экспоненциальному закону, в то время как неэкспоненциальная формараспределения говорит о многостадийности наблюдаемого процесса [47].
В работе Одде исоавторов 1995 года [43] было показано, что распределение времен жизни микротрубочкиимеет форму распределения, хорошо описываемую Гамма-функцией. Эти данныеинтерпретировались следующим образом: микротрубочке прежде чем она испытаеткатастрофу нужно пройти через несколько последовательно сменяющихся стадий. То естьчем дольше «прожила» микротрубочка, тем на более поздней стадии она находится и тем20больше вероятность катастрофы.
В случае же, если бы этот процесс был одностадийным,не было бы задержки во времени катастрофы для микротрубочек в начале роста изависимость частоты катастроф от времени была бы постоянна (Рис. 7, красная линия).Досихпорокончательнонеясно,чтопредставляютсобойгипотетическиемножественные события, приводящие к катастрофе микротрубочек. Было сделанонесколько попыток описать данный процесс. Согласно работам Gardner et al.
и BowneAnderson et al. [44,48], в микротрубочке в процессе роста могут возникать некие дефекты,дестабилизирующие ее. При этом эти дефекты, согласно рассматриваемой гипотезе,«запоминаются» и уже не исчезают. Накопление трех таких дефектов ведет кнаступлению катастрофы. Авторы предполагают, что одному такому дефекту можетсоответствовать случайно возникшая во время роста неспособность отдельногопротофиламента присоединять новые молекулы тубулина. А остановка в росте трехпротофиламентов согласно данной гитотезе приводит к катастрофе (Рис. 8А).А..БРис.
8. Гипотезы, описывающие «старение» микротрубочек. А. Три последовательнонакапливающихся необратимых дефекта приводят к катастрофе. Б. Непрерывноувеличивающаяся со временем заостренность микротрубочки дестабилизирует ее и такжеприводит к катастрофе.Другой вариант был предложен в работе Кумбс и соавторов 2013 года [42], в которойавторы предлагают на роль дестабилизирующего фактора последовательное изменениеструктурырастущегоконцамикротрубочки.Согласноихобъяснению,конецмикротрубочки в процессе роста заостряется и когда его скошенность становится21критической, микротрубочка испытывает катастрофу (Рис. 8Б).
В отличие от предыдущейгипотезы с тремя необратимыми дефектами, в этой работе приводятся данныематематического моделирования, а также эксперименты по оценке заостренности концамикротрубочкиспомощьюфлуоресцентноймикроскопиииэлектронныхмикрофотографий из работы Кретьен и соавторов 1995 года [49]. Однако статистическийанализ характеристики заостренности конца микротрубочки в зависимости от времени сиспользованием данных из той же экспериментальной работы, из которой были взятыданные для анализа Кумбс и соавторов [49], показал отсутствие статистическидостоверного монотонного увеличения заостренности со временем [50].1.2.4Размер слоя ГТФ-димеров на конце микротрубочкиКлассический эксперимент, направленный на изучение влияния ГТФ-димеров навозникновение катастрофы, был опыт in vitroпо разрезанию микротрубочкиультрафиолетовым сфокусированным пучком света[32]. После разрезания происходящеерегистрировалосьспомощьюдифференциальнойинтерференционно-контрастноймикроскопии (англ.: DIC).
Как и ожидалось, в соответствии с представлениями остабилизирующем свойстве ГТФ-колпачка,плюс-конец с отрезанной сторонынемедленно начинал разбираться. Примечательно, но до сих пор не объяснено то, чтоминус-конец со стороны разреза никогда не разбирался, а продолжал расти. Брюс Никлас[51] делал похожий опыт, но разрезал микротрубочку с помощью микро-иглы в клетке вмитотическом веретене.
Как и в предыдущем случае, микротрубочка немедленноразбиралась со стороны разреза на плюс-конце и всегда была стабильна на минус-конце.Эти эксперименты были восприняты как сильный довод в подтверждение наличиястабилизирующей ГТФ-структуры на растущем конце микротрубочки [25]. Такимобразом, ГТФ-колпачок защищает микротрубочку от разборки [25,52] и поэтому егоразмер является важной характеристикой динамической нестабильности.Попытка визуализации ГТФ-колпачка была предпринята с помощью рекомбинантныхантител, специфически взаимодействующие с ГТФ-тубулином.
Эти экспериментыпоказали наличие ГТФ-колпачка на концах растущих в клетках микротрубочек [53].22Численных оценок количества ГТФ-димеров однако не было приведено. Примечательно,что антитела связывались не только с концами микротрубочек, но и образовывали«островки» на поверхности микротрубочки вдали от конца. В пользу того, что небольшиеостровки ГТФ-тубулина есть в теле микротрубочки, говорит высокая (около 90%)корреляция места остановки разборки таких трубок с областями мечения. То есть ГТФслои предположительно могут иметь неоднородную структуру и даже образовыватьвключения в теле микротрубочки.
Но при этом нельзя полностью отвергнуть и другоевозможное объяснение – что специфичность антител была ниже предполагаемой, инаблюдалась неспецифичная детекция ГДФ-тубулина в теле микротрубочки.На сегодняшний день в научном сообществе нет единого мнения относительно размераГТФ-колпачка и его оценки разнятся от одного слоя до многих десятков слоев [54–58].Существует ряд работ, говорящих в пользу малого размера ГТФ-колпачка.
Самые ранниепопытки детектировать ГТФ-тубулин на конце микротрубочки не дали результатов,вследствие чего было сделано предположение, что размер ГТФ-колпачка настолько мал,что находится за гранью чувствительности метода и составляет всего несколько слоев[54,55]. Эксперимент, направленный на исследование размера ГТФ-колпачка, был сделанв группе Теда Салмона [59]. Идея состояла в том, что поскольку стационарный размерколпачка достигается за счет баланса с одной стороны присоединения ГТФ-димеров, а сдругой стороны – диссоциации димеров и гидролиза ГТФ [42,60], то быстрое удалениерастворимого тубулина после продолжительного роста микротрубочки должно привести котсутствию присоединения, а значит исчезновению ГТФ-димеров с конца микротрубочкии как следствие, к катастрофе.
Такой опыт был реализован в проточной камере снепрерывнымнаблюдениеминтерференционно-контрастноймикротрубочекмикроскопии.спомощьюМикротрубочкидифференциальнойвыращивалисьприпостоянной концентрации тубулина и затем тубулин быстро удалялся из камеры путемзамещения буферного раствора на тот, в котором нет тубулина.
В данных опытах былрассмотрен как плюс-, так и минус-конец микротрубочки и в обоих случаях катастрофынаблюдались в течение нескольких секунд после падения концентрации тубулина (Рис. 9).В результате катастрофа наступала через очень похожий промежуток времени для обоихконцов, а главное авторами не было обнаружено выраженной зависимости от начальной23концентрации тубулина, при которой выращивалась микротрубочка. Этот результат былинтерпретирован как свидетельство того, что ГТФ-колпачок остается одного и того жемалого размера вне зависимости от концентрации тубулина, а также как довод в пользумодели индуцированного гидролиза.В дополнение к этому опыту в других работах было продемонстрировано, что одного слояГТФ-тубулина достаточно для стабилизации микротрубочки от разборки [61,62].
Однаковажно отметить, что из этих работ не следует, что ГТФ-колпачок в растущеймикротрубочке составляет минимально необходимый один слой, он вполне может бытьбольше. Кроме того, эти работы не говорят о возможной структурной неоднородностиконца, при которой ГТФ-димеры могут быть смещены друг относительно друга иливообще не иметь боковых связей.Рис. 9.
Задержка до начала наступления катастрофы с момента начала удаления растворимоготубулина из камеры в зависимости от начальной скорости роста микротрубочек. Пунктирныелинии – линейная регрессия [59].Подход, основанный на оценке частоты высвобождения фосфата при гидролизе ГТФ в24растущих микротрубочках, в противоположность более ранним оценкам [63] указывает наочень малую задержку между присоединением димера и гидролизом связанного с нейнуклеотида, что считается аргументом в сторону небольшого ГТФ-колпачка и механизмаиндуцированного гидролиза [54,64,65].Другой способ оценки количества ГТФ-димеров in vitro на конце микротрубочки –использование флуоресцентно меченых белков.Таким белком может служить EB1,предложенныйсоставакаксенсорнуклеотидногомикротрубочки[66]иприсоединяющийся с большей афинностью к димерам, связанным с аналогом ГТФ –ГТФγS по сравнению с ГДФ-тубулином [67].
Сайт связывания EB1 с микротрубочкойнаходится в области между четырьмя соседними тубулинами и идеально подходит длятого, чтобы быть сенсором состояния γ-фосфата в β-тубулине [57]. И действительно,флуоресцентномеченыйЕВ1образуетнаконцахрастущихмикротрубочек«кометообразные» пятна длиной порядка сотни слоев тубулина (Рис. 10A), причеминтенсивность флуоресценции ЕВ1 спадает от конца к телу микротрубочки. Подобноераспределение EB1 может означать, что ГТФ-колпачок значительно длиннее одного слоятубулиновых димеров.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
