Диссертация (1103763), страница 6

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 6)

В нем  – экспоненциально распределеннаяслучайная величина со средним значением и стандартным отклонением равным 1 / a0 ( x ) ,при этом j – статистически независимая случайная целочисленная величина с условнойвероятностью a j ( x) / a0 ( x) (по сути вес отдельного события).Применительно к описанию эволюции микротрубочки используются следующиевеличины.

Параметр j  1, 2, 3 – одно из трех событий (присоединения, отсоединения,либо гидролиза ГТФ), k j  a j (x ) – характерное время наступления каждого из возможныхсобытий.Численныйметоднахождениястохастическойтраекторииэволюциимикротрубочки X (t ) включает следующие шаги:1)Инициализация времени t  t 0 и начального состояния системы x  x02)Для каждого мономера i и возможного элементарного событиягенерируется случайная величинаjrij , равномерно распределенная наинтервале от 0 до 13)Находятся все времена для каждого элементарного события:tij  4)ln(1  rij )kij(5)Произошедшим считается то событие, которому соответствует меньшеевремя tij .5)В соответствии с принятым событием обновляется конфигурация системы ипроизводится замена t  t  tij6)Повторяются шаги 2) – 5).Первыми попытками моделировать динамическую нестабильность микротрубочки спомощью кинетического метода Монте-Карло стали работы Хилла [102,60,77].32Рассмотрим кинетический подход на примере модели Хилла 1985 года.

В этой моделимикротрубочка представлена пятизаходной спиралью с 13 протофиламентами. МоделиХилла делались до получения структурных данных о строении конца растущей иразбирающейся микротрубочки и поэтому в них не было попыток учета измененияконформации конца при катастрофах и спасениях. Субъединицы в этой модели могутвстраиваться либо диссоциировать только единичными димерами и нет отдельногорассмотрения поочередного разрыва поперечной и продольной связи при диссоциации.Также димеры не могут существовать без одновременного наличия хотя бы одной ипродольной, и поперечной связи (Рис.

12А). Гидролиз в данной модели происходит сзадержкой, и в терминальном слое димеров, и в теле микротрубочки.Рис. 12. Схемы молекулярно-кинетических моделей микротрубочки. Микротрубочки показаны вразвернутом виде. Зеленым изображены ГДФ-тубулины, красным – ГТФ-тубулины. А. МодельЧена и Хилла (стрелками показаны участки, к которым может присоединиться субъединицатубулина), Б. Модель Бейли и соавторов с индуцированным механизмом гидролиза ГТФ.

В.Модель ВанБюрена и соавторов 2002 года. Г. Модель Марголина и соавторов 2012 года.Красными линиями показаны участки между протофиламентами, где разорваны поперечныесвязи.Хотя модель включает возможность рассмотрения отдельных вероятностей переходаГТФ-ГДФ в зависимости от положения димера, константы для этого перехода быливыбраны одинаковыми вдоль всей микротрубочки.С помощью такого подхода в модели Хилла были получены переходы между состояниямироста и укорочения, оценены константы этих переходов и описаны известные на тот33момент концентрационные зависимости.Дальнейшие исследования динамики отдельных микротрубочек привели к появлениюэкспериментальных работ, в которых были попытки оценить размер ГТФ-колпачка исвойства полярности микротрубочки.

Это в свою очередь привело к предположению оиндуцированном механизме гидролиза [78–81]. Бейли и соавторами была предложенадругая модель, с индуцированным правилом гидролиза, в которой ГТФ-тубулинынаходились строго лишь в терминальном слое независимо от концентрации тубулина врастворе (Рис. 12Б), а присоединение нового ГТФ-димера немедленно приводило кгидролизу ГТФ в димере, к которому он присоединился. Эта модель успешно описалаопыты с разбавлением растворимого тубулина и слабую зависимость частот катастрофмикротрубочек от концентрации тубулина.Кинетические модели Хилла и Бейли однако имели один общий недостаток – в них неучитывалась конформация конца микротрубочки, а значит они не могли описатьструктурные данные, соответствующие различным фазам роста микротрубочки.Попытка сделать качественный учет конфигурации конца была сделана в работеВанБюрена 2002 года [87]. Эта модель является существенным шагом вперед посравнению с предыдущими моделями и по сути стала переходной моделью кпоследующим механистическим способам описания динамики микротрубочки.

Она ужесодержит полностью современное представление о решетке микротрубочки – решетка Бтипа, трехзаходная левозакрученная спираль.Каждой связи в данной моделисопоставлена энергия, зависящая от нуклеотидного состава димеров, участвующих вовзаимодействии. То есть вероятность диссоциации димера зависит от того, гидролизованли ГТФ в его составе, и от количества связей. При этом димер мог присоединяться клюбому протофиламенту вне зависимости от того, приведет ли это к образованиюпоперечной связи (Рис. 12В).Что интересно, данная модель не может описать динамику микротрубочки при введенииправила индуцированного гидролиза ГТФ, так как при одиночном слое ГТФ-димеров наконце микротрубочки эта модель не описывает устойчивую фазу роста, и в результате нейнеобходимо использовать механизм случайного гидролиза.

При этом константа гидролиза,34откалиброванная по экспериментально измеренной частоте наступления катастроф [103],соответствовала размеру ГТФ-колпачка 55 димеров со стандартным отклонением 12димеров, что находится в согласии с экспериментальными данными о размере ГТФколпачка [56,59,61,62].Дополнительным шагом в понимании влияния структурных особенностей микротрубочкина ее динамику было то, что в работе ВанБюрена 2002 года [87] авторы попыталисьобъяснить вклад изогнутых протофиламентов на конце микротрубочки в ее динамическуюнестабильность.

В расчетах было получено, что модель не описывает устойчивую фазуразборки. Вместо этого разбирающаяся микротрубочка быстро возвращается в состояниеудлинения. Из этого было сделано предположение, что формирование раскрывающегосявенчика на конце микротрубочки необходимо для поддержания фазы разборки. Посколькурастрескивающаяся микротрубочка имеет на конце закручивающиеся протофиламенты, товновь присоединившиеся к ним ГТФ-димеры уже не будут оказывать стабилизирующеедействие, так как не будут способны образовать поперечные связи (Рис. 13).

Учестьнапрямую механику образования раскрывающегося венчика в кинетической моделинельзя,поэтомубыловведеноискусственноеограничение,уменьшающеестабилизирующие свойства терминальных ГТФ-димеров.Рис. 13. Влияние структурных изменений на конце микротрубочки на разборку. Слева –кинетическая модель, не учитывающая вклад отгибающихся протофиламентов при разборкемикротрубочки. Справа – эффект образования венчика протофиламентов уменьшаетстабилизирующие свойства ГТФ-димеров [87].Дальнейшим усовершенствованием кинетического подхода к описанию микротрубочкибыло рассмотрение раздельного разрыва сначала поперечной, а потом продольной связи вработе Марголина 2012 года [76] (Рис. 12Г).

Это правило дает возможность описания35различия в структурах растущего и укорачивающегося конца микротрубочки.Таким образом, от первых моделей Хилла до современных моделей изменялосьпонимание геометрии микротрубочки, правил присоединения и отсоединения димеров,правил гидролиза.Дальнейшее развитие кинетических подходов возможно в кооперировании их с болеесложными механическими моделями, что позволит упростить и ускорить процедурурасчетов, основываясь на извлеченных из механических моделей константах.1.3.3Однойизпервыхработ,Кинетико-механические моделиописывающихмеханикумикротрубочкинауровневзаимодействия отдельных димеров, была модель ВанБюрена 2005 года [42,88], по сутиусовершенствование предыдущей работы этой же группы – ВанБюрена 2002 года [87]. Вней поперечные и продольные взаимодействия между димерами описывались с помощьюквадратичных потенциалов Гука, которые при некотором заданном значении расстоянияпереходили в константу, исходя из значения максимальной по модулю энергии связи дляданного взаимодействия.Каждый мономер имеет три независимых координаты: два угла поворота φ и θ, а такжедлина D.

Углы θ и φ задают равновесное ненапряженное на изгиб направление векторамономера (Рис. 14). Угол θ соответствует изгибанию наружу протофиламента такимобразом, что для закручивающихся на конце микротрубочки ГДФ-димеров θ=22⁰, а дляпрямых ГТФ-протофиламентов θ=0⁰. Равновесный угол φ для обоих состояний 0⁰.36Рис.

14. Потенциалы взаимодействия в модели ВанБюрена и соавторов 2005 года. А. Углы,описывающие вращение димера. Б. Энергия изгибания димеров в протофиламенте в зависимостиот угла между осью димера и его предпочтительным направлением относительно нижележащегодимера в решетке микротрубочки. Вектор предпочтительной ориентации по углу зависит от того,ГТФ- (0,0 рад) или ГДФ-(0,2 рад) тубулин рассматривается. В.

Поперечная и продольная связи.Расстояние между сайтами взаимодействия d (продольное) и S(поперечное), Elat(Elong)– значенияглубины ямы потенциального взаимодействия для поперечной (продольной) связи.Отклонение текущего положения вектора от равновесного описывается квадратичнымпотенциалом. Величина D является суммой длины мономера (4 нм) и величинырастяжения вдоль протофиламента d. Взаимодействие между мономерами в соседнихпротофиламентах описывается с помощью расстояния между сайтами поперечноговзаимодействия S, которое вычисляется из координат {φ, θ, D}.

Растяжения d и Sописываются гуковскими потенциалами с разрывом по достижении максимальнойэнергии взаимодействия. Отклонение текущего вектора мономера от равновесного равноуглу Ф. Энергетический потенциал по углу Ф имеет также форму гуковского потенциала.После каждого события присоединения, гидролиза или отсоединения, для нахождения37координат {φ, θ, D} вблизи конца микротрубочки используется алгоритм минимизацииэнергии по очереди для каждой субъединице в микротрубочке.В данной модели микротрубочка рассматривается в каждый отдельный момент временикак квазиравновесная система.

Константа равновесияKгдеk(  )k(  )  Gtotal , exp k BT (6)k (  ) - константа реакции присоединения в единицах М-1с-1, k (  ) - константаотсоединения, Gtotal- полное изменение свободной энергии связывания для данногодимера, k B - константа Больцмана. Отсюда рассчитывается вероятность диссоциации:k () k()  Gtotalexp k BT(7)В случае, если для данной связи сумма энергии связи и энергии напряжения больше илиравна нулю, связь считается разорванной.Далее, когда энергия расчитана и найдены константы диссоциации, реализуетсякинетический алгоритм Монте-Карло как было описано выше [100,101]. Списоквозможных событий, реализуемых с помощью метода Монте-Карло, включает помимообразования и разрыва связей еще и гидролиз ГТФ.

Затем используется метод нахождениялокального энергетического минимума [104], после чего все предыдущие шагиповторяются.Данная модель уже может быть применена к описанию динамической нестабильностимикротрубочки, поскольку позволяет рассматривать переходы между фазами роста иразборки. Но несмотря на свою прогрессивность, использованный подход к описаниюмикротрубочки не лишен недостатков на самом базовом уровне. Во-первых, формапотенциалов описывается негладкой функцией с особенностью в точке разрыва связи:38градиент энергии в этой точке скачком падает от максимума в ноль. Во-вторых, методминимизации энергии, для адекватного описания структуры должен проходить сразу повсем переменным [104], а не для каждого димера в отдельности.

Характеристики

Список файлов диссертации