Метаболиты оксида азота в процессах свободнорадикального окисления в модельных системах и ткани миокарда (1103731), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Результаты диссертации могут быть также использованы для выясненияособенности действия уже используемых в медицинской практике доноров оксидаазота, таких как нитроглицерин и его аналоги пролонгированного действия.5Апробация результатов исследования и публикацииПо материалам диссертационной работы опубликовано 12 печатныхработ, в том числе 3 статьи в реферируемых научных журналах по списку ВАК.Результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались надевяти всероссийских и международных конференциях, в том числе на XIIмеждународной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых пофундаментальным наукам “Ломоносов-2005”, “Евразийском конгрессе помедицинской физике и инженерии.” (Москва, 2005), IV и V национальнойнаучно-практической конференции с международным участием “Активныеформы кислорода, оксид азота антиоксиданты и здоровье человека” (Смоленск,2005иСмоленск2007),VIЕжегодноймеждународноймолодежнойконференции ИБХФ РАН-ВУЗЫ (Москва, 2006), III съезде биофизиков России(Воронеж 2004), XIV и XV международной конференции и дискуссионномнаучном клубе “Новые информационные технологии в медицине, биологии,фармокологии и экологии” (Ялта-Гурзуф, 2006 и Ялта-Гурзуф, 2007).Структура и объем диссертационной работыДиссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (глава 1),методической части (глава 2), описания собственных результатов и ихобсуждения (главы 3), заключения, выводов и списка цитируемой литературы.Объем работы составляет 125 страниц, включая37 рисунков, 3 таблицы исписок литературы из 137 наименований.СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫВо введении дана общая характеристика диссертационной работы,обоснована актуальность темы, сформулированны цели и задачи исследования,кратко изложены научная новизна и практическая ценность полученныхрезультатов.Первая глава содержит литературный обзор, посвященный описаниюбиохимических и биофизических особенностей развития ишемического иреперфузионного повреждения миокарда,запрограмированной клеточнойгибели, активным формам кислорода, антиоксидантным системым клетки,донорам и метаболитам оксида азота.
Описан каскад6реакций апоптоза,рассмотренынаиболеевероятныезапрограмированной гибелисобытия,приводящиекиндукцииклеток при ишемическом и реперфузионномстрессе. Обобщены и проанализированы современные экспериментальныеданныепоиспользованиюингибиторовкаспазвразличныхмоделяхишемического/реперфузионного повреждения миокарда. Кратко изложеныосновные физико-химические свойства активных форм кислорода и азота,описаны их источники в биологических системах и взаимодействие сбиологическими молекулами.
Описана антиоксидантная система клетки, особоевнимание уделено роли коэнзима Q в антиоксидантной защите. Обобщены ипроанализированыэкспериментальныеданныепоцитопротекторнымицитотоксическим свойствам доноров и метаболитов оксида азота. Обоснованныцель и задачи диссертационной работы.Во второй главе представлены материалы и методы исследования.В разделе 2.1. перечислены и описаны используемые в данной работереактивы. Раздел 2.2. посвящен описанию моделирования региональной ишемиисердца крысы в условиях in vivo. Эксперименты проводились на крысах-самцахлинии Wistar. Крысы были наркотизированы внутрибрюшинно этаминаломнатрия, после чего им был имплантирован катетер в бедренную артерию длянаблюдения АД и ЧСС, и в яремную вену для последующего добавления наркозаи окрашивания зоны риска.
Животным производилась трахеостомия, после чегоживотные подключались к аппарату искусственной вентиляции легких.Региональная ишемия миокарда вызывалась перевязкой нисходящей ветви левойкоронарной артерии на уровне нижнего края ушка левого предсердия в условияхвскрытой грудной клетки. В разделе 2.3. описана методика проведения гельэлектрофореза ДНК кардиомиоцитов ткани миокарда после ишемии/реперфузии.Раздел 2.4. посвящен описанию методики синтеза S-нитрозотиолов и ДНКЖКонцентрацию GSNO, CysNO и ДНКЖ определяли методом спектроскопии ЭПР.
Вразделе2.5.описана методика свободнорадикального окисление гомогенатамиокарда крыс. Сердца крыс линии Wistar измельчались, смешивались с 40 мМ Na,Kфосфатным буфером (рН 7.4) и гомогенизировались в стеклянном гомогенизаторе стефлоновым пестиком до получения однородной массы. Окисление гомогенатамиокарда инициировали добавлением гидропероксида трет-бутила и метмиоглобина7или метгемоглобина. Перед окислением в гомогенат добавлялись различныеконцентрации PAPA/NONO, соли Ангели, GSNO, CysNO, NaNO2 и ДНКЖ. Раздел2.6.
посвящен описанию методики определения ТБК-реактивных продуктов. Дляопределения концентрации ТБК-реактивных продуктов отбирались аликвотыгомогената миокарда (1мл), окисление в которых останавливалось добавлением BHT иДТПА. Аликвоты препаратов миокарда добавлялись к 2 мл 10% растворатрихлоруксусной кислоты и 1 мл 0,67% раствор ТБК, после чего смесь помещалась вводяную баню на 30 мин. После этого образцы охлаждались и центрифугировались.Измерениевторичныхпродуктовперекисногоокисления(ТБК-реактивныхпродуктов) проводилось в надосадке по оптическому поглощению при 532 нм (ε = 1,56.5-1-110 М см ), в качестве базовой линии использовался отрезок спектра между 515-550нм. В разделе 2.7.
описана методика определения концентрации коэнзимов Q9 и Q10 вгомогенате ткани с использованием метода высокоэффективной жидкостнойхроматографии (ВЭЖХ). Раздел 2.8. посвящен методике регистрации и обработкиспектров ЭПР. Регистрацию спектров ДНКЖ проводили при комнатнойтемпературе (~25°С) и температуре жидкого азота (-196°С). Аликвоты образцовгомогената (300 мкл) замораживали в жидком азоте, помещали в кварцевыйдьюар в резонаторе спектрометра ЭПР, после чего записывали спектры при СВЧмощности 10 мВт, СВ частоте 9,33 ГГц, амплитуде ВЧ модуляции 0,2 мТл.
Вописана методика получения изолированных митохондрии сердцаразделе 2.9.крысы. Раздел 2.10. посвящен описанию экспериментов по изучению влиянияаторвастатина и коэнзима Q на свободнорадикальную резистентность миокарда.Статистическую обработку полученных результатов проводили, используяприложения программы Origin 7.0 фирмы Microcal Software, Inc. (США).Результаты представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего.Втретьейпредставленыглавенепосредственнорезультатыисследований.В разделе 3.1. приведены результаты исследования влияния ишемииразличнойдлительности,некротическойгибелинабалансзапрограммированнойкардиомиоцитовнамодели(апоптоз)ирегиональнойишемии/реперфузии сердца крысы in vivo.
Наркотизированные самцы крысылинии Wistar были подвергнуты 15-минутной или 25-минутной региональной8ишемиимиокардавусловияхвскрытойгрудной клетки и искусственной вентиляциилегких. Баланс апоптической и некротическойгибеликлетокмиокардаоценивалипоприсутствию на негативах гель электрофорезаДНК характерной для апоптоза «лесенки» ихарактернойдлянекрозаразмытой,диффузионной структуры. Как видно изрисункахарактерная1aзапрограммированнойдляклеточнойaгибелиb«лесенка» ДНК наиболее четко проявилась вобразцахмиокардаишемиииреперфузии.после15-минутнойпоследующейтрехчасовойДействительно,работаспецифической для апоптоза эндонуклеазыCADприводиткразрезаниюРис.
1. Гель электрофорез ДНК,выделенной из зоны риска миокардакрыс после 15-минутной (a) и 25минутнойэкспериментальнойишемии (b). Реперфузия в обеихгруппах проходила в течение 3часов.ДНКапоптической клетки на фрагменты кратные 180 п.о.Диффузионный типразрушения ДНК характерный для некроза проявляется в виде сплошной,размытой структуры при гель электрофорезе. Подобную структуру можнонаблюдать в случае 25-минутной ишемии (рис.
1 b). Кроме того, в группеживотныхподвергшихся15-минутнойэкспериментальнойишемииДНКмиокарда в целом была менее подвержена деградации. Следует отметить, чторасщепление ДНК на фрагменты, кратные 180 п.о. является одним из наиболеепоздних событий при апоптической гибели клетки. Формирование «лесенки»при гель электрофорезе ДНК из образцов миокарда свидетельствует о большомколичестве клеток, дошедших до стадии расщепления ДНК, не подвергшихсяпри этом гибели по механизму некроза. Действительно, прохождение полногоцикла реакций, характерных для апоптоза, требуют целостности клетки иопределенного значения внутриклеточной концентрации АТФ.Известно, что длительность ишемии влияет на образование АФК в тканимиокарда при последующей реперфузии. Было показано, что увеличениедлительностиишемииприводиткзначительному9увеличениюсинтезарадикалавмиокарде на модели региональнойишемии сердца крысы in vivo.Также показано, что увеличениедлительности ишемии усиливаетобразование АФК митохондриямивыделеннымиизмиокарда.Концентрация ТБКреак тивных продук тов,мк Мгидроксильно21,51(2)0,5(1)00a2040 60 80 100 120Инкубация, мин.15 мин.
ишемии миокарда припоследующейпроисходитреперфузииобразованиедостаточноедляАФК,активациизапрограммированной клеточнойгибели,приэтомстепеньКонцентрация ТБКреак тивных п родук тов,мк ММожно предположить, что после1,5чтонепроисходит развитие процессагибели клетки по механизмунекроза.Такимобразом,экспериментальная 15-минутнаяишемияявляетсякорректнойвполнемоделью4140 12 3 43121 2 300bтакова,00,5свободнорадикальногоповреждения0230Инкубация, мин.90Рис.
2. Ингибирование индуцированногогидропероксидом трет-бутила (40 мкМ) иметмиоглобином (30 мкМ) ПОЛ гомогенатамиокарда крысы в присутствии различныхконцентраций PAPA/NONO. Рис. 2a, кривая (1)– концентрация PAPA/NONO равна 100 мкМ,кривая (2) – контроль. Рис. 2b: (0) – контроль;(1),(2),(3),(4) – PAPA/NONO в концентрации800, 400, 200, 100 мкМ, соответственно.дляисследования апоптоза кардиомиоцитов на ранних этапах реперфузии примоделировании региональной ишемии сердца в условиях in vivo. Необходимоотметить, что полученные данные справедливы для использованной намимодели и могут отличаться в других моделях.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
