Математическое моделирование процесса фототрансдукции в палочках сетчатки (1103711), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Это приводит к гиперполяризации клеточной мембраны, что и является фазойактивации фотоответа.Рис.1. Схема каскада фототрансдукции. Обозначения: Р – родопсин, Т – трансдуцин, Ф –фосфодиэстераза, ГЦ – гуанилатциклаза, РК – родопсинкиназа, Ар – арестин, Рек рековерин.8Фаза восстановления фототоответаПосле генерации фотоответа зрительный рецептор должен вернуться к исходномутемновому состоянию.
Для этого необходимо, чтобы цГМФ-чувствительные каналыперешли обратно в открытое состояние, что в свою очередь требует восстановлениятемнового значения концентрации цГМФ.Это обеспечивается, с одной стороны, за счет кальций-зависимого усиления работыгуанилатциклазы. Закрытие цГМФ-зависимых каналов не позволяет поступать кальцию вклетку, что приводит к снижению его концентрации в цитоплазме, и соответственно кускорению работы гуанилатциклазы.С другой стороны, необходимо «выключить» активные формы фосфодиэстеразы иродопсина.Первый процесс обеспечивается ГТФ-азной активностью трансдуцина:k2рТ α ⋅ ГТФ ⋅ ФДЭ →Т α ⋅ ГДФ + ФДЭ + Ф ik2рТ α ⋅ ГТФ ⋅ ФДЭ ⋅ Т α ⋅ ГТФ → Т α ⋅ ГТФ ⋅ ФДЭ + Т α ⋅ ГДФ + Ф iВторой процесс обеспечивается кальций-зависимой инактивацией метародопсинаII.
Активный родопсин последовательно фосфорилируется родопсинкиназой, причемактивность родопсинкиназы регулируется внутриклеточной концентрацией кальция: приуменьшении[Ca2+]процессфосфорилированияродопсинаускоряется.Далеефосфорилированная форма родопсина связывается с белком арестином, который при этомблокирует каталитические центры родопсина.k 1 р , РKM II + Ф i → M II ⋅ Ф ik 1 арM II ⋅ Ф i + Ар → M II ⋅ Ф i ⋅ АрПостроение математической моделиХотя сами реакции активации фотоответа определены, константы скоростей длянекоторых из них неизвестны (k2, k4, k6 – три этапа взаимодействия родопсина странсдуцином, k7, k8 – взаимодействие трансдуцина с фосфодиэстеразой).
Для оценкизначенийнеизвестныхПредставленныевконстантлитературевработеданные,использовалсяполученныеследующийметодомподход.светорассеяниявреконструированных системах («сигнал диссоциации» и «сигнал ФДЭ»), позволяютнаблюдать кинетику двух промежуточных продуктов фототрансдукции. Используя этиданные, в диссертационной работе была проведена оценка неизвестных констант:99 на основе «сигнала диссоциации» были определены константы k2, k4, k6 ;9 на основе «сигнала ФДЭ» были определены константы k7, k8.Дальнейшее упрощение модели касалось фазы восстановления фотоответа.
Так,экспериментальное изучение кинетики фототоков показало, что фазу восстановления-t/τфотоответа можно довольно точно описать одноэкспоненциальной кривой f(t)=e .Параметрτвпоказателеэкспонентыбылназван«временнойдоминантой».Одноэкспоненциальная кинетика характерна для химических реакций первого порядка.Такимобразом,формафазывосстановленияфотоответаопределяетсяоднойлимитирующей реакцией. По литературным данным, ключевым этапом, определяющимфазу восстановления фотоответа, является процесс инактивации родопсина. Причем,связываниеродопсинасарестиномпротекаетнамногобыстрее,чемегофосфорилирование.
Таким образом, можно считать, что «временная доминанта»характеризуетпроцессфосфорилированияродопсинаисоответствуетзначениюконстанты k1р=1/τ. Рассмотрение экспериментальных кривых фазы восстановленияфотоответа позволило получить значение τ=2.4 сек.Рис.2. Моделирование фазы активации фотоответа палочки сетчатки.Сплошные линии – экспериментально измеренные фототоки (по данным работы (Pugh andLamb, 1990)), штриховые линии – теоретически рассчитанные кривые фототоков.Стрелкой обозначен момент световой вспышки. Засветка вызывает активацию: 10-1 (1),10-3 (2), 10-4 (3) молекул родопсина.Теоретическое решение получено на основе данных по светорассеянию.10Рис.3. Моделирование фазы восстановления фотоответа палочки сетчатки.Сплошные линии – экспериментально измеренные фототоки (по данным работы(Schleicher et. al., 1989)), штриховые линии – теоретически рассчитанные кривыефототоков.
Стрелкой обозначен момент световой вспышки. Засветка вызываетактивацию: 2.5⋅10-6 (1), 8⋅10-6 (2), 2.5⋅10-5 (3) молекул родопсина.Теоретическое решение получено на основе данных по светорассеянию.Такимобразом,послеоценкизначенийвсехнеизвестныхпараметроввдиссертационной работе была построена система дифференциальных уравненийописывающая как активацию, так и восстановление фотоответа. Решение данной системыбыло получено численно с использованием метода Эйлера.Теоретическирассчитанноерешениеобеспечилоблизкоесовпадениесэкспериментальными фототоками в широком интервале засветок (рис. 2 и 3). Такимобразом, построенная модель (с константами, полученными на основе сигналовсветорассеяния)позволяетвцеломадекватноописатькинетикупроцессафототрансдукции темно адаптированной палочки в ответ на одиночные вспышки.Определение критических этапов кинетики процесса фототрансдукцииВ данной главе было проведено исследование процесса активации фотоответа напредмет выявления критических реакций.
Активация фотоответа в палочках сетчатки11представляет собой сложную последовательность биохимических реакций, в которойсочетаются как линейные этапы, так и процессы усилительного характера:9 во-первых, каждая молекула возбужденного родопсина каталитически активируетнекоторое количество молекул трансдуцина;9 во-вторых, активная форма фосфодиэстеразы также каталитически гидролизуетмолекулы циклического ГМФ.В рамках данного исследования было проведено несколько серий теоретическихрасчетов. Внутри каждой серии варьировалось значение одной из кинетических констант,характеризующих скорость протекания соответствующей реакции, и наблюдалосьрасхождение получаемых кривых фототока от рассчитанных изначально.
В качествеколичественного параметра, характеризующего различие между двумя кривыми,использовалось время достижения полумаксимальной амплитуды фототока (время наполовине высоты кривой (Т1/2)).Сводные результаты по влиянию рассмотренных кинетических параметров на общуюкинетику фототрансдукции представлены на рис.4-5.
Как видно из представленныхданных, построенная модель оказалась наиболее чувствительной к изменению скоростиреакций:k4M II ⋅ Т + ГТФ →M II ⋅ Т ⋅ ГТФk6Т ⋅ ГТФ →Т α ⋅ ГТФ + Т βγk7Т α ⋅ ГТФ + ФДЭ →Т α ⋅ ГТФ ⋅ ФДЭk 9 ; KmТ α ⋅ ГТФ ⋅ ФДЭ + цГМФ → Т α ⋅ ГТФ ⋅ ФДЭ + ГМФНекоторое влияние на общую кинетику оказывают изменения скоростей реакций:k1M I →M IIk2M II + Т ⋅ ГДФ →M II ⋅ Т ⋅ ГДФпричем, влияние этих реакций несимметрично. Варьируя данные константы можнодобиться лишь замедления кинетики фототока, но не ее ускорения.
Это свидетельствует отом, что скорость протекания данных реакций достаточно высока, чтобы не вноситьзаметных задержек в процесс активации фотоответа.Остальные реакции, составляющие фазу активации фотоответа, не оказываютзначимого влияния на общие кинетические параметры системы фототрансдукции.1250%45%40%35%30%25%20%15%10%5%0%к1к2к4к6к7к8к9к10КМРис.4. Уменьшение времени на «полувысоте» фототока (по отношению к стандартному),при увеличении значений констант скоростей реакций в 10 раз (константа КМ былауменьшена в 10 раз, т.к.
ее действие имеет обратное направление влияния).100%90%80%70%60%50%40%30%20%10%0%к1к2к4к6к7к8к9к10КМРис. 5. Увеличение времени на «полувысоте» фототока (по отношению к стандартному),при уменьшении значений констант скоростей реакций в 10 раз (константа КМ былаувеличена в 10 раз, т.к. ее действие имеет обратное направление влияния).Построение модели при использовании констант, полученных альтернативнымиметодамиВ последние годы появились данные о кинетике фототрансдукции, полученные вэкспериментах с использованием радиоактивного негидролизуемого аналога ГТФ13(ГТФγS), при этом скорость активации трансдуцина полученная таким способом (150 сек-1на1молекулувозбужденногородопсина)сильноотличаласьотрезультатовэкспериментов по светорассеянию (~ 1000 сек-1).
Таким образом, возник вопрос –насколько критично такое сильное снижение скорости активации трансдуцина дляадекватного описания фототока? Для ответа на данный вопрос в диссертационной работебыло проведено варьирование констант скоростей реакций в физиологически допустимыхпределах, таким образом, чтобы скорость активации трансдуцина была равна 150 сек-1, нокинетикафототокаоставаласьтакойже,какиранее,т.е.удовлетворялаэлектрофизиологическим наблюдениям.Первая часть задачи – понижение скорости активации трансдуцина – сводится крассмотрениюпоследовательностипятиреакцийвзаимодействияродопсинастрансдуцином. Проведенный анализ показал, что замедление активации трансдуцина до150 сек-1 можно обеспечить за счет изменения значений констант k2 и k4 (два этапакаталитической активации трансдуцина родопсином).
Для этого необходимо, чтобы либоk2=0.22 (сек⋅µМ)-1, либо k4=4.2⋅10-2 (сек⋅µМ)-1, вместо значений k2=69 (сек⋅µМ)-1, k4=1.1(сек⋅µМ)-1, полученных на основе данных по светорассеянию.Вторым этапом было проведено рассмотрение возможности компенсации сниженияскорости активации трансдуцина. Проведенный анализ показал, что такую компенсациюможно обеспечить за счет увеличения скорости работы фосфодиэстеразы. Исследованиемодели обнаружило, что увеличение констант скоростей реакций k7 и k8 (реакциивзаимодействия трансдуцина и фосфодиэстеразы) не позволяет добиться необходимогорезультата. Поэтому увеличить скорость гидролиза цГМФ можно только за счетувеличения частоты оборота фосфодиэстеразы или за счет уменьшения значенияконстанты Михаэлиса. При этом частота оборота фосфодиэстеразы, использованная впервой модели (k9 = 2600 сек-1, k10 = 2900 сек-1), и так является очень высокой дляферментовэтогосемейства,поэтомуееувеличениевмоделипредставляетсянефизиологичным.
С другой стороны, экспериментальные данные имеют достаточноширокий разброс значений при оценке константы Михаэлиса. Проведенное варьированиеконстанты Михаэлиса показало, что необходимое значение Км равно 1 µМ (вместо Км=40µМ в первоначальной модели), которое укладывается в представленные в литературеоценки.Кроме представленного выше, существует еще один путь увеличения эффективностигидролиза – это изменение буферной силы цитоплазмы для цГМФ. В предыдущемрассмотрении значение буферной силы было равно 2. Очевидно, что уменьшениебуферной силы будет эквивалентно некоторому увеличению скорости гидролиза цГМФ14фосфодиэстеразой. Минимальное физиологическое значение буферной силы равноединице. Однако даже этот минимум не способен сам по себе компенсироватьуменьшение скорости активации трансдуцина. Проведенное моделирование показало, чтодля BP=1 значение константы Михаэлиса должно быть равно 5 µМ (что все равносущественно меньше 40 µМ – значения, использовавшегося в первоначальной модели).На рис.6 проведено сравнение двух теоретических кривых.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
