Изучение сенсорных свойств органических и полимерных пленок на твердой основе (1103011), страница 5
Текст из файла (страница 5)
При обоих способах посадки молекул IgG было обнаружено, что связавшиеся молекулы пероксидазы повышают поверхностное натяжение рецепторной пленки, поэтому кантилевер изгибается в сторону иммобилизированного слоя антител. Аналогичные результаты, полученные на других объектахисследования, объяснялись некоторыми авторами изменением электростатическогозаряда и полярности образующихся иммунных комплексов. На основе полученныхданных (табл. 1), предполагается также, что ослабления латеральных сил в биополимерной пленке могут быть связаны с эффектом уменьшения конфигурационнойэнтропии комплексов, обусловленной увеличением компактности или «жесткости»иммунных пар. В более общей форме генезис поверхностного натяжения белковыхпленок связывается с реорганизацией ее субъединиц, стремящихся минимизироватьсвободную энергию системы в целом.Глава 5 посвящена исследованию процессов образования фибрилл вблизиповерхности в зависимости от ее типа на примере лизоцима из куриных яиц.21Для определения кинетики агрегации лизоцима вблизи поверхности белок cконцентрацией 1мг/мл иммобилизировался на поверхности кантилевера, покрытойзолотой пленкой, с помощью метода химической прививки из ацетатного буфера(pH = 4,5).
Белок также химически прививался к гидрофильной кремниевой поверхности кантилевера в то время, когда его сторона, покрытая золотом, оставалась немодифицированной. Установлено, что время процесса агрегации соседних молекулковалентно иммобилизованного монослоя лизоцима на золоте при комнатной температуре и pH = 3,0 составляет 14 часов, после чего в монослое возникает плотнаясетка фибриллярных образований. Как известно, агрегация в объеме происходит вПоверхностное натяжение,Н/мтех же условиях при более высокой температуре, ≈ 57 оС.0,04а0,0250,01-0,00502468101214-0,02бв-0,035-0,05г-0,065Время протекания процесса, чРис. 18.
Зависимость от времениповерхностного натяжения пленки лизоцима, находящейся а) накремниевой и г) золотой поверхностях кантилевера. б), в) Результаты двух контрольных экспериментов, единственное отличиекоторых заключается в отсутствии этапа обработки кантилеверализоцимом, показаны соответственно для золотой и кремниевойповерхностей кантиливера.Обнаружено также, что кинетический коэффициент развития латеральныхнапряжений в монослое лизоцима на модифицированной гидрофобной (золотой)поверхности в 4.6 раз выше, чем на модифицированной гидрофильной (кремниевой)поверхности (рис.18), что коррелирует с данными атомно-силовой микроскопии,согласно которым среднее количество фибрилл на указанных подложках различается в 5 раз (рис.
19). Таким образом, было установлено, что скорости роста фибриллпропорциональны скоростям развития сил агрегации молекул лизоцима на поверхностях с различными свойствами.22а) 1 мин., фибриллы отсутствуютб) 4,5 ч. высота фибрилл 3.0±0.4 нмв) 19 ч., плотная сетка фибрилл: более 30 на кадре13Х13мкм, высота фибрилл 3-10 нмг) после 16 ч., плотность фибрилл: 5±2 на кадре13Х13мкмРис. 19.
Изменение формы агрегатов лизоцима на гидрофобной поверхности золота а), б), в)и гидрофильной отрицательно заряженной поверхности слюды (кремния); г) в различныемоменты времени нахождения монослоя в буфере (pH = 3,0) при химической иммобилизации белка.Для расчета силы взаимодействия двух соседних молекул лизоцима в пленкена основе экспериментальных данных (рис. 18а, г) использовалась модель гексагональной упаковки молекул в монослое (глава 7), состоящего из белковых глобул,каждая молекула которого взаимодействует с шестью соседними.
Полученное значение силы взаимодействия составило 113 ± 24 пН, что близко к значению силы(FT4=64±16 пН), которую необходимо приложить к агрегату, состоящему из не23скольких мономеров лизоцима T4 для того, чтобы разорвать связь между 21 и 124остатками одного мономера.В главе 6 рассмотрена модель колебаний балки, закрепленной с одного конца, в свободном колебательном состоянии. Модель позволят численно рассчитыватьизменения собственной частоты кантилевера при изменении массы, сосредоточенной на его незакрепленном конце.Глава 7 содержит новый метод оценки сил парных взаимодействий соседнихбелковых глобул в монослойной пленке, иммобилизованной на поверхности кантилевера, с учетом принятия допущения о структуре пленки.
В данной модели рассматривается плотнейшая гексагональная упаковка белковых молекул на поверхности кантилевера (рис. 20).Рис. 20. Модель плотнейшей гексагональной упаковки монослоя белка наповерхности кантилевера. Стрелкамиуказаны направления действия силмежмолекулярных взаимодействий ирезультирующей силы, влияющей наповерхностное натяжение белковойпленки.Результирующая сила взаимодействия Fрез, приходящаяся на одну молекулубелка и представляющая собой суммарный вклад со стороны двух соседних молекул в эффективное поверхностное натяжение (рис. 20), рассчитывается по формулеFрез = σd ,(1)где d – характерный линейный размер (диаметр) молекулы, σ – поверхностное натяжение монослойной пленки. При расчете силы взаимодействия двух молекул F2учитывалось, что при образовании плотнейшего монослоя, состоящего из белковыхглобул, каждая молекула взаимодействует с шестью соседними. Из принятой модели плотнейшей гексагональной упаковки следует, что результирующая сила Fрезможет быть разложена по базису сил парных взаимодействий молекул (рис.
20), тогда24F2 =Fрез2 cos(π / 6).(2)В главе 8 на основе мирового экспериментального опыта и новых данныхатомно-силовой микроскопии белковых фибрилл, полученных в данной работе,предложена модель, описывающая механизм организации ковалентно иммобилизованных молекул на подложке в фибрилы.Рис. 21. Качественнаямодель образования фибрилл в монослое гексагонально упакованных белковых молекул.
а) Трехмерная модель, б) двумерная модель сеченияфибриллы.Если считать молекулы сферами, прикрепленными к поверхности за одинлинкер (рис. 21б), то, опираясь на данные атомно-силовой микроскопии поверхности монослоя лизоцима на золоте, содержащего фибриллы (рис. 19б), можно предположить, что в процессе агрегации происходит изменение конформации молекулыбелка таким образом, что одна ее часть переходит непосредственно в фибриллу, адругая, находящаяся в частично денатурированном состоянии, остается вне ее жесткого стержня.Выводы1.
Впервые произведен прямой контроль сил, действующих в монослойных пленках группы серосодержащих соединений, во время их самоорганизации на золотой поверхности микрокантилевера. В низкомолекулярных пленках выявленымеханизмы генерации латеральных сил, обусловленные гидрофобным и электростатическим взаимодействием между мономерами пленки. Показана связь сил,действующих в пленке, со структурой ее мономерного звена.2.
Впервые создан микрокантилеверный анализатор с рецептором из молекул бис4-(2-пиридилметиленаминофинил)дисульфида, селективный к ионам тяжелыхдвухвалентных металлов – Co2+, Cu2+, Ni2+, образующих с этими молекулами хелатный комплекс. Показано, что механический изгиб кантилевера главным обра25зом зависит от двух конкурирующих факторов: конформационных трансформаций молекул в слое и изменения их зарядовой плотности. Определен порог чувствительности сенсора – 10-7 М.3.
Разработаны методики ковалентной и физической иммобилизации белков накремниевой и золотой поверхностях кантилевера. Впервые реализованы высокоселективные микрокантилеверные анализаторы на основе пары комплиментарных биополимеров – пероксидазы хрена и IgG – с чувствительностью к нескольким наномолям пероксидазы в литре буферного раствора. Показано, что конформационные изменения молекул IgG при связывании с пероксидазой уменьшают энтропию системы и генерируют аналитический сигнал деформаций кантилевера.4.
Впервые проведена реакция диссоциации макромолекулярного комплекса антитело–конъюгат (морфин-овальбумин) под действием морфина на поверхностикантилевера, показавшая, что скорость анализа морфина, по конкурентной схеме, может быть выше, чем скорость прямого анализа, проводимого с помощьюкантилеверных сенсоров, за счет резкого снятия напряжений в рецепторе (придесорбции молекул антител), возникающих при длительном процессе реорганизаций молекул рецепторного слоя.5. Впервые произведен контроль агрегации молекул лизоцима, физически и ковалентно иммобилизированных на поверхности кантилевера и образующих плотноупакованный монослой, посредством регистрации средних силовых напряжений в пленке.
Обнаружено что агрегация молекул в связанном состоянии на поверхностях золота, кремния и слюды происходит в условиях, при которых в объеме они не агрегируют.6. Построена универсальная модель изгиба кантилевера при взаимодействии субъединиц пленки, имеющих плотнейшую упаковку, которая позволяет производить расчет средней силы их парных взаимодействий. Предложена качественнаямодель, объясняющая возможность образования фибрилл из молекул белка, находящихся в связанном состоянии на поверхности.26Список публикаций по теме диссертации1.Е.В.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
