Изучение сенсорных свойств органических и полимерных пленок на твердой основе (1103011), страница 4
Текст из файла (страница 4)
12. Сорбция антител на поверхность кантилевера, содержащую конъюгат овальбумина сморфином.неоднородностью раствора, шум всистеме увеличивался, но сила из-гиба кантилевера оставалась прежней. Данные результаты говорят о том, что кантилевер с иммобилизированным антигеном можно использовать в качестве теста, позволяющего анализировать плазму крови на предмет содержания в ней специфических антител, при диагностике различных заболеваний или допинг-теста.Поверхностное натяжение, Н/м0 ,0 5Увеличенный фрагментвыделенной области1 0 0 м к г /м л1 0 м к г /м л3 м к г /м л0 ,0 40 ,0 30 ,0 1 9 80 ,0 20 ,0 10 ,0 0 9 80-0 ,0 0 0 20- 0 ,0 13691215Рис.
13. Десорбцияантител с поверхностисенсора под действиемморфинасконцентрациями 3, 10 и100 мкг/мл- 0 ,0 201020304050607080Вр е м я п р о т е к а н и я п р о ц е с с а , м и нИнтенсивный изгиб балки в начале процесса десорбции антител при введенииморфина (5–10 мин) объясняется резким снятием напряжения в рецепторной пленке(рис. 13) при появлении в ней структурных дефектов.
После интенсивного изгиба16кантилевера, сопровождающегося разрушением монослоя связанных молекул антител, начинается параллельный конкурирующий процесс реорганизации белковогослоя в рецепторе, что приводит к значительному замедлению развития напряженийв пленке и потере информативности аналитического сигнала.Таким образом, с использованием микрокантилеверов впервые проведены реакции образования и разрушения биополимерных комплексов на поверхности кантилевера по конкурентной схеме. Пороговая чувствительность сенсора к морфинусоставила 3 мкг/мл.
Полученные результаты позволяют говорить о потенциальнойприменимости микрокантилеверных преобразователей для детектирования низкомолекулярных веществ в плазме крови животных или человека.В разделе 4.2 основной задачей являлось определение возможности прямогоанализа белков с помощью микрокантилеверных систем, а точнее, экспериментальное определение степени латеральных напряжений в монослойной пленке макромолекул IgG при связывании с классическим белком – пероксидазой хрена (ПХ).
Вомногих методах прямого анализа аналитический сигнал вырабатывается в результате изменения плотности рецепторного слоя, которое может быть обусловлено такженеспецифическим связыванием посторонних биополимерных объектов, содержащихся в анализируемом растворе. Вслучае определения фактов связывания аналита с помощью измерениясил, генерируемых в белковом слое,степень влияния неспецифическогосвязывания на аналитический сигналзаметно уменьшается благодаря низким энергиям неспецифических свя- Рис.
14. Архитектура рецептора микрокантилеверного анализатора пероксидазы хрезей и, следовательно, их незначи- на: а) при иммобилизации IgG с помощьютельному вкладу в поверхностное на- белка А на позолоченную сторону кантилевера, б) при ковалентной иммобилизациитяжение рецепторной пленки.антител на кремниевую сторону кантилевеВ данной работе ставилось це- ра.лью сопоставление эффективности методов физической иммобилизации (с помощью белка А) и статистической ковалентной прививки IgG на поверхности кантилевера (рис. 14) по отношению к генерируемому сигналу связывания антигена.
Для17исключения неспецифического связывания c немодифицированной поверхностьюкантилевера, не имеющей рецепторного слоя, она блокировалась химически привитым БСА (метод ковалентной иммобилизации белков описан в разделе 4.1.2).После добавления ПХ в фосфатный солевой буферный раствор (ФСБР) сpH = 7,0 кантилевер с физически иммобилизованным рецептором начинал деформироваться в сторону рецепторного слоя (кинетика изгиба показана на рис. 15).Поверхностное натяжение,Н/м0,0500246810-0,051214Рис. 15. Кинетика изгиба кантилевера сфизически иммобилизированнымрецепторным слоем привведении раствора ПХсконцентрацией3 мкг/мл.16Пероксидаза хрена (3 мкг/мл)-0,1Экспоненциальное приближение-0,15-0,2Вводпероксидазы-0,25-0,3Время протекания процесса, чПосле регенерации сенсора в глициновом буфере с pH = 3,0 и повторной постадийной иммобилизации антител его чувствительность к пероксидазе понизиласьболее чем в четыре раза (см.
табл. 1).С помощью атомно-силового микроскопа был произведен контроль свойствповерхности рецепторного слоя кантилевера на стадиях подготовки и функционирования сенсора. На рисунке 16 показаны изменения параметров шероховатостиповерхностей в результате появления на ней новых белковых комплексов:1Ra =N1rn , Rq =∑Nn =1NN∑ rn , Rsk =2n =11NRq3N∑rn =1n3, Rmax ,где Ra, Rq, Rsk , Rmax – средняя и среднеквадратичные шероховатости, параметр симметрии, максимальный профиль поверхности соответственно; rn – высоты точекмассива изображения; N – число точек.
Исходя из данных, полученных с помощьюАСМ, можно сделать вывод, что на поверхности образуются специфические иммунные пары антител с пероксидазой, которые изменяют рельеф рецепторного слояс увеличением параметров шероховатости, т.е. на поверхности появляются качественно новые объекты, очевидно, влияющие на развитие сил в сенсорном слое.18бвШероховатость (Ra, Rmax, Rq, Rsk), нма1,2г1Ra0,8Rmax0,6Rq0,4Rsk0,20Белок АБелок А+IgGБелокА+IgG+ПХРис. 16. Изображения поверхностей золота с нанесенными а) белком А, б) белком А и IgG, в) белком А, IgG и ПХ; г)графики нормированных шероховатостейкаждой из поверхностей.При высоком уровне воспроизводимости после нескольких циклов регенерации кантилевер с ковалентно иммобилизированными макромолекулами IgG (рис.17)показал чувствительность в полтора раза меньшую, чем в случае иммобилизацииантител с помощью белка А.
Блокировка поверхности сенсора, не являющейся рецепторным слоем, обеспечила невосприимчивость анализатора к внешним неспецифическим воздействиям контрольных белков (БСА и овальбумина) при высокихконцентрациях (рис. 17).Сопоставляя результаты контроля иммунохимических реакций на поверхности кантилевера (табл. 1), можно увидеть, что в результате физической иммобилизации антител на поверхности кантилевера силы, возникающие в монослое антител,в полтора раза больше, чем при химической прививке.
Это связывается с увеличен19ной мобильностью молекул IgG на поверхности в комплексе с белком А и жесткойдетерменированностью их посадки на поверхность, в результате чего конформационные изменения молекул IgG при образовании иммунной пары могут быть большими, чем при случайной химической иммобилизации антител.Поверхностное натяжение,Н/м0,250,20,150,10,050-0,05 00,511,522,533,5-0,1-0,15Контроль1 БСА (1 мг/мл)Контроль2 Овальбумин (1 мг/мл)Пероксидаза цикл N (3 мкг/мл)Пероксидаза цикл N+1 (3 мкг/мл)-0,2-0,25Время протекания процесса, чРис. 17.
Кинетика изгиба кантилевера с ковалентно иммобилизированным рецепторным слоем при N-ом и (N+1)-ом циклах регенерации в глициновом буфере (pH = 3,0)при введении раствора ПХ с концентрацией 3 мкг/мл. Контрольные белки БСА иовальбумин с концентрациями 1 мг/мл. Нулевой уровень отклонений кантилевера сигналов контрольных белков для наглядности смещен в сторону отрицательных значений.Известно, что в непосредственной близости к поверхности многие белковыемолекулы из-за частичной денатурации могут в значительной степени изменитьсвою конформацию, кроме того при афинном типе связывания IgG с белком химическая прививка не позволяет молекулам IgG естественным образом изменять пространственную структуру, т.е.
константа связывания антител может уменьшиться.20Таблица 1. Сравнение характеристик рецепторных слоев молекул IgG, закрепленных на поверхности с помощью методов физической и химической иммобилизации.ПараметрыанализатораМетодиммобилизацииФизическая прививкаЧувствительность (максимальная сила изгибапри одинаковых концентрациях, 3 мкг/мл, завремя работы анализатора), Н/м.Воспроизводимостьпосле регенерации(отношение сил изгиба кантилевера дои после его регенерации)0,28± 0,030,23±0,001Химическаяпрививка0,18± 0,020,89±0,04Невосприимчивость к БСА иовальбуминуБСА – естьОвальбуминданных нетБСА – естьОвальбуминестьСкорость работы сенсора приодинаковыхконцентрацияханализируемоговещества, ч-1–0,33±0,01–0,77±0,03Химическая прививка показала два основных достоинства, связанных с болеевысокой концентрацией IgG на поверхности, обеспеченной методом иммобилизации: повышенная скорость определения аналита и высокая степень воспроизводимости результатов после физического разрушения белкового комплекса IgG и ПХ спомощью глицинового буфера (pH = 3,0).
Высокая степень воспроизводимости помаксимальной силе аналитического сигнала (чувствительности) связана, повидимому, с отсутствием сложных белковых комплексов, помимо образовавшихсяиммунных пар в рецепторном слое, которые в «кислой» среде глицинового буфера(pH = 3,0) могут необратимо агрегировать, из-за чего константа связывания антителможет значительно понизиться.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
