Изучение взаимодействия кинетохоров хромосом с микротрубочками (1103003), страница 5
Текст из файла (страница 5)
рис. 3. Но тогда из-за такого сильного связывания наблюдалась бы остановка ДАМ–кольца, движущегося за деполимеризующим концом микротрубочки, при столкновении слюбым ниже лежащим на микротрубочке ДАМ-кольцом, но в [Westermann 2006] наблюдалось скоплением ДАМ-пятен на конце деполимеризующегося конца микротрубочки без замедления скорости деполимеризации. Поэтому было решено воспроизвести опыты [Wester20mann 2005, 2006] в нашей системе, где инициация деполимеризации микротрубочек происходила с помощью промывки проточной камеры от свободноплавающих димеров тубулина.Непосредственно перед этим на микротрубочках можно было видеть в основном образование очень слабых ДАМ-пятен, диффундировавших вдоль микротрубочек, в отличие от четкихнеподвижныхДАМ-пятен,образовавшихся при использовании стандартного протокола.
Этосвидетельствует о том, что этобыли по большой части ДАМпатчи с редко попадающимисяДАМ-кольцами на микротрубочках. Поэтому можно заключить,Рис. 16. Графики зависимости положения концевогофлуоресцентного ДАМ-пятна (черный) относительноминус конца микротрубочки и его относительной интенсивности (серый) с течением времени при деполимеризации микротрубочки. Слева графика показаноначальное изображение микротрубочки, покрытойДАМ-пятнами. Видны только наиболее яркие пятна,хотя в микроскоп можно было наблюдать и очень слабые ДАМ-патчи, диффундирующие вдоль микротрубочки.что плавающий в растворе тубулин, по-видимому, обладает ингибиторным действием на образование ДАМ-колец на микротрубочках.При деполимеризации микротрубочек можно было действительно наблюдать увеличение интенсивностиконцевогоДАМ-пятна (см.
рис. 16), что объясняется не сбором ДАМ-колец, как делали это авторы в [Westermann 2005, 2006], а накоплением более подвижных ДАМ-патчей на конце микротрубочки,возможно при этом упаковывающихся в ДАМ-кольцо. Если же ДАМ-пятно, следующее задеполимеризующимся концом микротрубочки, наталкивалось во время своего движения надругое яркое ДАМ-пятно (ДАМ-кольцо), то происходила остановка деполимеризации микротрубочки.
В таком положении система обычно находилась несколько секунд, после чегодвижение концевого ДАМ-пятна восстанавливалось. При этом было заметно понижение интенсивности концевого пятна по сравнению с тем, которое оно имело во время паузы. Этосвидетельствует о сбрасывании с конца микротрубочки лишних Dam1 комплексов. Чтобыопределить, какое из двух ДАМ-пятен на микротрубочке – ближнее или дальнее от разби21рающегося конца, продолжает движение после окончания паузы, были сделаны эксперименты с обесцвечиванием крашенных Dam1 комплексов путем облучения их лазером с длинойволны 488 нм. Оказалось, что при вхождении в эту зону обесцвечивания, интенсивностьконцевого ДАМ-пятна резко падала, а затем возрастала после выхода из зоны. Это говорит отом, что при столкновении одного ДАМ-пятна с другим во время деполимеризации микротрубочки разбирается то, которое стоит ближе к концу микротрубочки, а дальнее от концапятно затем продолжает движение.Эти экспериментальные данные не описываются моделью Хилла [Hill, 1985].ДАМ-кольца С-мутанта Dam1 двигаются при разборке микротрубочки с большими, чем вслучае нативного Dam1, скоростями.
В статьях [Wang, Miranda 2007] было показано, что Сконцы Dam1p белков подходят на роль линкеров между ДАМ-кольцом и микротрубочкой,поэтому возникает вопрос – как же влияетотсутствие этих линкеровнадвижениеДАМ-колец, которыевсе еще образуютсявокругРис. 17. Справа изображена кимограмма движения концевогоДАМ-пятна, состоящего из C-мутантного Dam1, при деполимеризации микротрубочки. Слева изображены графики зависимости положения концевого ДАМ-пятна относительно минус конца микротрубочки (черный) и его относительной яркости с течением времени, построенные для этой кимограммы (серый).микротрубо-чек, хотя и при большихконцентрациях.Для этойпоставленыцели былиэкспери-менты, в которых изаксонем, прикреплен-ных к покровному стеклу проточной камеры, выращивались микротрубочки, растущиевнутрь проточной камеры.
Затем туда вмывался С-мутантный Dam1 комплекс, у которогобыли удалены С-концы Dam1p белков. Большинство ДАМ-пятен, образовавшихся вдольмикротрубочек, обладали довольно таки сильной диффузией и не большой яркостью, чтоговорит об образовании ДАМ-патчей на микротрубочках мутантным Dam1 комплексом и оего пониженных свойствах образовывать ДАМ-кольца, хотя они иногда присутствовали намикротрубочках. При этом при инициализации деполимеризации микротрубочек можно бы22ло наблюдать увеличении яркостиконцевого ДАМ-пятна с ростомпройденного расстояния, см. рис.17. А средняя скорость его движения была равна 20 ± 1 мкм/мин (N =177), т.е.
очень близка к скоростиразборке свободной микротрубочки, и приблизительно в три разабольше, чем для ДАМ-колец, соРис. 18. Диаграммы распределения скоростей движения концевых ДАМ-пятен при деполимеризациимикротрубочек для случая нативного Dam1 (белая) иС-мутантного Dam1 (черная). Также приведена диаграмма распределения скоростей деполимеризациимикротрубочек в отсутствии какого бы то ни былоDam1 (серая).стоящих из нативного Dam1, см.диаграмму на рис. 18. Эти экспериментальные данные говорят о том,что в природе не реализуется качественная гипотеза электростатическогоскольженияДАМ-кольца[Wang, 2007].ВЫВОДЫ1.
На основе последних экспериментальных данных построена детальная молекулярномеханическая модель взаимодействия микротрубочки и ДАМ-кольца, включающая в себягипотезу линкеров – белковых мостиков, соединяющих ДАМ-кольцо с микротрубочкой.2. С помощью полученной математической модели показано, что кольцо с жесткимилинкерами обладает малым КПД ~10%, в то время как линкеры с маленькой изгибной жесткостью позволяют кольцу эффективно преобразовывать энергию деполимеризации микротрубочки в полезную механическую работу с КПД ~ 50% даже при сильном связываниилинкеров с поверхностью микротрубочки ~ 13 kT.3.
Показано, что в модели существует два типа движения кольца при разборке микротрубочки – по механизму диффузии со смещением при слабом связывании линкеров с микротрубочкой и по механизму силового давления при сильном связывании. При этом во втором случае наблюдается перешагивание линкеров кольца с одного сайта связывания намикротрубочке в другой подобно движению кинезинов.4.
На основе экспериментальных измерений доказано, что ДАМ-кольца двигаются по23механизму силового давления во время деполимеризации микротрубочек. Во время этогопроцесса наблюдается прецессия оси кольца вокруг оси микротрубочки.5. Экспериментально показано существование ни кем ранее не описанных не кольцевыхДАМ-стурктур, которые в отличие от ДАМ-колец имеют большой коэффициент диффузиивдоль микротрубочки.6. При деполимеризации микротрубочек не кольцевые ДАМ-патчи следуют за разбирающимся концами микротрубочек подобно ДАМ-кольцам.Список работ, опубликованных по теме диссертации:1. Molodtsov M.I., Grishchuk E.L., Efremov A.K., McIntosh J.R., Ataullakhanov F.I.
2005.Force production by depolymerizing microtubules: a theoretical study. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,102:4353-8.2. Efremov A.K., Grishchuk E.L, McIntosh J.R., Ataullakhanov F.I. 2007. In search of an optimal ring to couple microtubule depolymerization to processive chromosome motions. Proc. Natl.Acad.
Sci. USA, 104:19017-22.3. Ефремов А.К., Кочиков И.В., Трубецков М.К., Тихонравов А.В., Атауллаханов Ф.И.,Механическая модель микротрубочки // III Съезд Биофизиков России, сборник тезисовдокладов, Воронеж, 24-29 июня 2004, стр. 38.4. E.L. Grishchuk, M.I. Molodtsov, A.K.Yefremov, I.S. Spiridonov, F.I. Ataullakhanov andJ.R. McIntosh. 2006. Mechanisms of poleward chromosome movement. 2006. 46th annual ASCBmeeting.
December 9-13. San Diego, CA.5. E.L. Grishchuk, A.K. Efremov, I. S. Spiridonov, V.A. Volkov, S. Westermann, I.M.Cheeseman, A. Desai, D. Drubin, G. Barnes, F.I. Ataullakhanov, J.R. McIntosh. Biomechanicaldesign of molecular couplers that transduce microtubule depolymerization into chromosomemovement. 2007. 47th annual ASCB meeting. December 1-5. Washington, DC. p.
451.6. J. McIntosh, M. Morphew, D. Mastronarde, A. Yefremov, K. Zhudenkov, E. Grishchuk, F.Ataullakhanov. Kinetochore-microtubule interactions visualized by EM tomography. 2007. 47thannual ASCB meeting. December 1-5. Washington, DC. p. 603.7. Жуденков К.В., Ефремов А.К., Грищук Е.Л., МакИнтош Р., Атауллаханов Ф.И. Исследование структуры кинетохорных элементов, взаимодействующих с микротрубочкой.11-я международная пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология - наукаXXI века", сборник тезисов докладов.
Пущино, 29 октября - 2 ноября, 2007, стр. 9.24.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
