Изучение взаимодействия кинетохоров хромосом с микротрубочками (1103003), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Мной были проведены эксперименты, аналогичные [Westermann 2006] по диффузии флуоресцентных ДАМпятен вдоль стабилизированных таксолом микротрубочек, закрепленных за покровное микроскопное стекло. При этом мы использовали микротрубочки, выращенные из биотинилированного тубулина, а стекло непосредственно перед экспериментом было покрыто стреп15тавидином.
В результате связывания микротрубочек с покровным микроскопным стеклом,ДАМ-кольца с трудом могли образовываться вокруг них,исходя из стерических соображений. Это предположениеподтверждается и электронными фотографиями ДАМпятен, сделанных Грищук Е.Л., которые образовывались натаких связанных с поверхностью микротрубочках, см. рис.10B. Из изображения видно, что Dam1 чаще образует структуры в виде недостроенных ДАМ-колец, – ДАМ-патчей(Dam1-patches).Все флуоресцентные ДАМ-пятна, связанные с микротрубочками, делились на две категории, см. кимограмму, изображенную на рис. 12. Первая категория – более яркие пятРис. 10. A.
Электроннаяфотографиябиотинилированной микротрубочки, лежащей на связывающей поверхностивотсутствииDam1 в растворе. B. Тоже,что и в А, только на этот разс Dam1 в растворе. Dam1 образовал на поверхности микротрубочки структуры, частьиз которых точно не являются замкнутыми кольцами(показаны белыми стрелками). C. Электронная фотография свободноплавающеймикротрубочки с ДАМкольцом на ней.на, которые совсем не двигались и сидели на одном местена микротрубочке в течение всего эксперимента. Вторая –очень подвижные пятна, которые часто сливались друг сдругом или наоборот разбивались на пару более слабыхдиффундирующих пятен.
Динамические более слабыеДАМ-пятна никогда не проходили сквозь яркие неподвижные пятна, «отскакивая» от них. Это говорит о том, что такое яркое ДАМ-пятно занимает все протофиламенты микротрубочки, поэтому нет ни однойобходнойдорогивокругэтой структуры.Т.к. в электронныймикроскопне было видно образования каких-либо агрегатовиз Dam1, покрывающих все протофиламенты,кроме ДАМ-колец, то, по-видимому, эти яркиеДАМ-точки как раз представляли собой эти16Рис.
11. Зависимость эффективного коэффициента диффузии флуоресцентныхДАМ-пятен вдоль микротрубочек от ихотносительной яркости.кольца.Характерно, что при увеличении яркости ДАМ-пятна падалего коэффициент диффузии, см.диаграмму на рис. 11, что говорит о присутствии на микротрубочках ДАМ-комплексов с разным количеством Dam1 комплексов и связей, образованныхс микротрубочкой, и состоящихиз разного количества Dam1.Причем чем больше флуорес-Рис.
12. Кимограмма флуоресцентных ДАМ-пятен,сидящих на микротрубочке, которая закреплена на связывающей поверхности. Из рисунка видно, что все пятнаделятся на две группы – яркие неподвижные и болееслабые, диффундирующие вдоль микротрубочки (белыестрелки).ценция ДАМ-пятна, тем больше крашеного Dam1 входит в его состав, тем больше образуется у такого пятна связей с микротрубочкой и тем меньше его коэффициент диффузии, начиная от значений, обнаруженных в работе [Westermann 2006] и кончая полной остановкойДАМ-пятна.
Если взять верхнюю оценку коэффициента диффузии для самых ярких пятен издиаграммы на рис. 16 и подставить в теоретический график на рис. 6, то оказывается, чтосоответствующая глубина ДАМ-потенциала будет не менее 6-7 kBT.В заключении об этом эксперименте стоит сказать, что, по-видимому, в работе [Westermann 2006] как раз и наблюдали диффузию таких ДАМ-патчей на адсорбированных к стеклу микротрубочках, хотя приписывали ее движениям полных ДАМ-колец, что, повидимому, оказалось неверным.
В нашей экспериментальной работе была впервые показанавозможность существования высокодинамичных ДАМ-патчей на микротрубочке, которыевполне возможно могут играть немалую роль во время митоза.Микрошарики, покрытые Dam1 комплексом, ускоряют разборку микротрубочек и обладают высокой процессивностью движения. Для того чтобы исследовать более подробновозможность ДАМ-патчей трансформировать упругую энергию напряжений в стенке микротрубочки в механическую работу, были использованы микрошарики, покрытые меченымалексой 488 Dam1 комплексами.
Микротрубочки выращивались из шкурок тетрахимен, адсорбированных на покровном стекле. Затем в проточную камеру вмывались покрытые шарики, большинство из которых повисало на микротрубочках. Непосредственно перед вмы17ванием в проточную камеру эти шарики тщательно были отмыты от свободных Dam1 комплексов, не связавшихся с поверхностью шариков и плавающих в растворе. Таким образом,эти шарики при зацепленииза микротрубочку не образовывали ДАМ-колец.
Это подтверждалось наблюдениями втечение всего эксперимента –на микротрубочках не быловидимых во флуоресцентномканале ДАМ-пятен. При иниРис. 13. Диаграммы распределения скоростей движенияшариков, покрытых Dam1, при деполимеризации микротрубочек для случаев отсутствия (серая) и присутствия(черная) Dam1 в растворе.циации разборки микротрубочек путем облучения ихзеленым светом 44% шариковотваливались от микротрубо-чек, но оставшиеся 56% (231 шарик) начинали двигаться за разбирающимися концами микротрубочек вплоть до самого сайта нуклеации.
В среднем такие шарики проходили порядка7-10 мкм. При этом средняя скорость движения этих шариков была равна 29.8±3.4 мкм/мин(N=248), см. рис. 13, что было больше, чем средняя скорость разборки свободных микротрубочек 21.8±0.6 мкм/мин (N=57) в той же системе в отсутствии шариков, см. рис. 18. Следовательно, шарики, покрытые Dam1 комплексом в отсутствии свободноплавающего Dam1в растворе, обладают деполимеризующей активностью и двигаются при разборке по механизму диффузии со смещением аналогично шарикам в [Lombillo, Peskin 1995, Tao 1998].Уменьшение плотности покрытия Dam1 комплексом поверхности шариков ведет куменьшению их скорости движения за деполимеризующимися концами микротрубочек.При проведении экспериментов аналогичным тем, что упоминались в предыдущем пункте,с разными плотностями покрытия поверхности шариков Dam1, была получена зависимость,изображенная на рис.
14. И хотя график состоит всего из трех точек, хорошо заметна тенденция уменьшения скорости движения шариков с уменьшением количества Dam1 на ихповерхности. Это служит доказательством того, что в такой постановке эксперимента не наблюдается формирование ДАМ-колец при присоединении шарика к микротрубочке.
Т.к.18иначе понижение плотности Dam1 на шариках приводило бы к меньшему числу образующихся ДАМколец, соединенных с шариком. А это бы приводилов свою очередь к увеличению скорости движенияшариков при деполимеризации микротрубочки. Такое поведение шариков в зависимости от плотностипокрытия Dam1 наряду с их свойством ускорять деполимеризацию микротрубочек хорошо объясняется моделью диффузии со смещением, предложеннойв [Peskin 1995] для аналогичных экспериментов,правда с другим белком.Проводя такие же эксперименты, только в присутствии Dam1 комплекса в растворе оказалось, чтоРис.
14. Зависимость относительной скорости движения шариков придеполимеризации микротрубочек отплотности их покрытия Dam1 комплексами.в этом случае средняя скорость движения шариков за разбирающимися концами микротрубочек равна 9.4 ± 2.9 мкм/мин (N=119), что приблизительно в три раза меньше, чем в отсутствии свободно плавающих Dam1 комплексов, см.
рис. 13. Это объясняется образованием ДАМ-колец вокруг микротрубочек в месте присоединения шариков.В пользу этого говорят измерения, проведенные на шариках с помощью лазерной ловушки. Оказалось, что сила, развиваемая деполимеризующейся микротрубочкой, на стрептавидиновые шарики, заРис. 15. Диаграммы динамических характеристик сигналов, возникающих при перемещении шариков под действием деполимеризующихся микротрубочек, измеренных в опыте слазерной ловушкой.цепленные за биотинилированные микротрубочки [Grishchuk 2005] по своей амплитуде и продолжительности гораздоменьше, чем в случае шариков, покрытыхDam1, с присутствием Dam1 в растворе,см. диаграмму на рис. 15. Эти экспериментальные данные объясняются тем, что в первомслучае нет ДАМ-кольца между шариком и микротрубочкой, поэтому шарики гораздо легче19отваливаются от деполимеризующихся концов микротрубочек, что и дает маленькую продолжительность силы.
Кроме того, в первом случае на эти шарики давление оказывают всего 2-3 протофиламента, исходя из стерических соображений. Во втором случае, повидимому, образуется ДАМ-кольцо между шариком и микротрубочкой, в результате чего нашарик посредством ДАМ-кольца давят все 13 протофиламентов, что создает силу раз вшесть большую, чем в случае стрептавидиновых шариков, что и наблюдается в экспериментах. Таким образом, эти данные говорят о наличии ДАМ-колец вокруг микротрубочек, связанных с шариками, в присутствии Dam1 в растворе. При этом на самих микротрубочках вофлуоресцентном канале видны неподвижные ДАМ-пятна, которые, следовательно, являютсякандидатами на ДАМ-кольца.Более детальная обработка экспериментов с лазерной ловушкой показала наличие прецессии оси ДАМ-кольца вокруг оси микротрубочки, которая также наблюдается и в теории.ДАМ-кольца in vitro двигаются по механизму силового давления.
В дальнейшем я решилвыяснить – как влияет разборка микротрубочки на движение ДАМ-колец. В этих экспериментах проточная камера с микротрубочками, выращенными из аксонем, приготовлялась,как описано в «методах и материалах». При этом в конце промывки проточной камеры в неедобавлялся буфер Б с Dam1 с такой концентрацией, чтобы на микротрубочках образовалисьотчетливо видимые ДАМ-пятна, которые, как было показано выше, представляли собойДАМ-кольца.
Исходя из верхней оценки коэффициента диффузии таких пятен, глубинаДАМ-потенциала взаимодействия имеет значение > 6-7 kBT. И, следовательно, такое кольцопри деполимеризации микротрубочки должно было бы двигаться по механизму силовогодавления. Т.к. механизм диффузии со смещением не может объяснить, как малоподвижноеДАМ-кольцо двигается со скоростями 7.2 ± 0.3 мкм/мин (N = 209), померенными в этих экспериментах. Как видно из графика на рис. 8, такая скорость движения ДАМ-кольца соответствует глубине ДАМ-потенциала порядка 13-14 kBT, при которой также наблюдается согласие со структурными данными ДАМ-колец, полученных с помощью электронной микроскопии, см.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
