Изучение взаимодействия кинетохоров хромосом с микротрубочками (1103003), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Продольные связи «голова к хвосту» мы считали нерастяжимыми и отвечающими только за из6гибание протофиламентов, а потенциал этого взаимодействия описывался функцией gk,n =B· (χk,n–χo)2/2 , где χk,n = τk,n – τk-1,n – угол между k-ым и (k-1)-ым мономерами в n-ом протофиламенте, τk,n – угол между k-ым мономером в n-ом протофиламенте и осью микротрубочки, эти углы являются независимыми переменными в модели; B – параметр, характеризующий изгибную упругость связи.
Потенциал боковых взаимодействий мономеров мы описывали функцией ν(r) = A·(r/ro)2·exp(-r/ro) , где А и ro – параметры потенциала, r = r (τk,n) – расстояние между боковыми центрами взаимодействия тубулинов.Модель ДАМ-кольца. Из экспериментальных данных известно, что ДАМ-кольцо состоитиз ~ 16 субъединиц. Но для упрощения модели считалось, что кольцо состоит из 13. Такоеупрощение не ограничивает общности модели, поскольку образование дополнительных 3связей стерически не возможно.
Кольцо в расчетах имело внутренний диаметр 33 нм [Westermann 2005, Miranda 2005]. От каждой из 13 субъединиц кольца к одному из 13 протофиламентов идет линкер – белковый мостик комплекса Dam1, ответственный за взаимодействие с микротрубочкой. Каждый линкер описывался линейным стержнем длиной 4 нм. Считалось, что каждый линкер может сжиматься в продольном направлении, а также выгибаться из плоскости кольца, при этом в расслабленном состоянии все линкеры направлены вцентр кольца. Исходя из результатов статьи [Westermann 2005] я предположил, что центрсвязывания линкера с димером тубулина находится на α-мономере тубулина.
Положениесайта взаимодействия линкера с α-мономером тубулина показан белым кружочком на рис.1. Для простоты расчетов считалось, что подвижный конец каждого линкера все время движется по внешней поверхности соответствующего протофиламента. Следовательно, каждыйлинкер будет описываться одной степенью свободы, не включая координат ДАМ-кольца. Вкачестве нее был взят угол αn между плоскостью кольца и направлением линкера.
Эти углы,так же как и углы τk,n являются независимыми переменными в нашей модели. Кроме того кнезависимым переменным относятся три координаты положения центра ДАМ-кольца в пространстве Xc, Yc, Zc и три угла Эйлера для него θ, φ, ψ. Таким образом, углы τk,n, αn, θ, φ, ψ икоординаты Xc, Yc, Zc составляют весь набор независимых переменных системы, которыйобозначим Ω.Энергия продольной деформации n-го линкера равна qn(∆ln) = kspring·∆ln2/2 , где kspring – коэффициент продольной жесткости линкера; ∆ln = ∆ln(Ω) – абсолютное изменение длинылинкера. А энергия изгибания n-го линкера равна pn(βn) = kflex·βn2/2 , где kflex – коэффициент7изгибной жесткости линкера; βn = βn(Ω) – угол отклонения линкера от равновесного положения.Кроме этих двух энергий, описывающих свойства упругости линкеров в модель былавведена энергия взаимодействия подвижного конца линкера с α-мономерами тубулина.
Онааппроксимировалась формулой dn(ρn) = –kDAM·exp(–ρn2/rDAM2) , где kDAM – параметр, описывающий глубину ямы; rDAM – параметр, характеризующий ширину потенциальной ямы, ρn =ρn(Ω) – расстояние от подвижного конца n-го линкера до центра взаимодействия на ближайшем α-мономере.Выбор значений констант модели. Параметр χo был выбран исходя из структурных данных [Muller-Reichert 1998] – угол между соседними ГДФ-димерами тубулина в протофиламенте в расслабленном состоянии равен 0.4 радиана. Для простоты считалось, что этот уголесть сумма равных интердимерного и интрадимерного изгибания между мономерами тубулина, т.е.
равновесный угол χo = 0.2 радиана в обоих случаях. Другой параметр – B в формуле был выбран из соображения, что вся энергия гидролиза ГТФ, связанного с β-мономеромтубулина, – EH = 7.3 ккал/моль = 12.3 kBT, [Lehninger 1993] , запасается в стенке микротрубочки в виде упругих напряжений. Следовательно, B = EH/ χo2 ≈ 300 kBT/рад2. Для соответствия температурной зависимости скорости разборки микротрубочки был подобран параметр A, который оказался равен 28 kBT, а величина барьера боковой связи Ebarrier = 4Ae-2 ≈ 15kBT.
Поэтому разность энергии барьера боковой связи мономера и энергии запасенной впродольной связи мономера равна ∆Etheor = Ebarrier – EH/2 = 15 kBT – 6 kBT = 9 kBT, что соответствует экспериментальным данным ∆Eexp = (4.8 ± 0.6) ккал/моль ≈ (8 ± 1) kBT [Molodtsov2005b].Дальнейшие расчеты модели показали, что от изменения величины kspring на порядок полученные далее динамические зависимости не сильно меняются, поэтому эта величина вовсех приведенных ниже расчетах была фиксирована и равна kspring = 0.13 Н/м. Такой коэффициент упругости для стержня длиной 4 нм площадью поперечного сечения 1 нм2 соответствует модулю Юнга E = 5·108 Н/м2, характерному для многих белков.Расстояние типичного белок-белкового взаимодействия составляет 1-2 Å [Jiang 2002].Поэтому параметр ro из формулы был выбраны равными ro = 0.8 Å, т.к. длина связи равна2ro = 1.6 Å.
Это же касается и параметра rDAM , который был взят равным 1.4 Å.Также в модели необходимо задать коэффициент диффузии свободного ДАМ-кольца в8воде. Для этой цели были взяты данные по измерению коэффициента диффузии Dam1 декамеров в воде [Miranda 2005] и был оценен коэффициент диффузии свободного ДАМ-кольцав растворе по порядку величины как D = 10-7 см2/с.Таким образом, в модели микротрубочки, взаимодействующей с ДАМ-кольцом, естьтолько два важных параметра – kflex, kDAM, от которых сильно зависят конечные результаты.Экспериментальная установка. Все эксперименты с проточной камерой были сделаны насветовом микроскопе Zeiss Axiophoto2, адаптированным под конструкцию лазерной ловушки.
Изображения движущихся флуоресцентных Dam1 комплексов были получены с интервалом в 5 секунд в виде z-стеков, включающих в себя 3-4 плоскости с шагом в 0.3 мкм. Этобыло необходимо, т.к. микротрубочки, на которых сидят ДАМ-пятна, совершают колебательные тепловые движения и часто выходят из фокальной плоскости микроскопа, чтосильно сказывается на величине интенсивности ДАМ-пятен.
Экспозиция камеры в каждойплоскости была равна 400 мс. Изображения движущихся шариков, покрытых Dam1 комплексом, при деполимеризации микротрубочки, снимались с использованием DIC микроскопии и выдержкой видеокамеры 100 мс для каждого кадра.Реагенты и белки. Большинство реагентов были куплены у Sigma и Molecular Probes. Негидролизуемый аналог ГТФ, GMPCPP, был приобретен у Jena Bioscience. Тубулин был получен из коровьих мозгов путем по протоколу из [Weingarten, 1975]. Мечение тубулина родамином и биотином было выполнено по стандартному протоколу из [Hyman, 1991].
В качестве центров нуклеации тубулина использовались лизированные шкурки тетрахименыили аксонемы, присланные из университета штата Миннесоты. Стеклянные микрошарикибыли приобретены у Spherotech Inc и обработаны по протоколу из [Asbury, 2006].Приготовление проточной камеры к экспериментам. Эксперимент проводился в термостати-руемой (32°С) проточной камере, основой которой служили предметное и покровноестекла, разделенные слоем двустороннего скотча. Схема эксперимента представлена на рис.2. До начала эксперимента шкурки тетрахимены (или аксонемы) помещались на покровноестекло, после чего камера заполнялась буфером А (BRB-80, 4 мМ MgCl2, 2 мМ DTT, 0.5мг/мл казеина), собиралась и запечатывалась силиконом (Kwik-cast, WPI, Inc). После этогоне адсорбировавшиеся на покровном стекле шкурки тетрахимены (аксонемы) вымывалисьиз камеры 300 мкл буфера А на скорости 100 мкл/мин.
Затем в камеру вмывался ГТФтубулин концентрации 1.4 мг/мл (с 1 мМ ГТФ) со скоростью 30 мкл/мин. Спустя 15 мин,9когда микротрубочки вырастали до размеров ~ 10 мкм, камера промывалась четырьмя объемами GMPCPP-тубулина (1:3 тубулин был мечен родамином) в концентрации 0.4 мг/мл (с1 мМ GMPCPP) со скоростью 30 мкл/мин. За время промывки камеры на плюс концах микротрубочек нарастало несколько слоев GMPCPP-тубулина и микротрубочки становилисьустойчивыми и не чувствительными кразбавлениюконцентрациисвободноплавающих димеров тубулина.
Благодаряэтому камеру можно было хорошо отмыть от остатков свободно плавающего врастворе меченого родамином тубулина.Кроме того, благодаря наличию крашеного родамином тубулина на GMPCPP кон-Рис. 2. Схематическое изображение эксперимента.чиках микротрубочек, можно было инициировать деполимеризацию микротрубочек, находящихся в поле зрения микроскопа, уничтожая GMPCPP кончики микротрубочек путем ихосвещения зеленым светом, на котором поглощает родамин. Отмывка камеры производилась все тем же буфером А на скорости 10 мкл/мин в течение 5 минут. Затем камера промывалась буфером Б, за основу которого брался буфер А с добавлением BSA до концентрации0.5 мг/мл и 1% 2-меркаптоэтанолом.В некоторых экспериментах в проточную камеру добавлялся раствор буфера Б с Dam1комплексом там, где это отдельно оговаривается в тексте.
Меченный краской Dam1 комплекс был любезно предоставлен Вестерманом, университет Беркли, Калифорния. Непосредственно перед введением в проточную камеру Dam1 разводился в буфере Б до концентраций порядка 3-30 нМ.Результаты.Увеличение жесткости линкеров кольца ведет к уменьшению силы связывания кольца смикротрубочкой. Расчеты модели для разных kflex показали, что с ростом изгибной жесткости линкеров падает количество связей между ДАМ-кольцом и микротрубочкой. При kflex =2000 kBT/рад, максимальное количество линкеров, взаимодействующих с сайтами связывания на микротрубочке, в каждый момент времени ≤ 3 и эта цифра не зависит от kDAM.
Прижесткости kflex = 200 kBT/рад с сайтами взаимодействия на микротрубочке связываются по 79 линкеров кольца, а при kflex = 20 kBT/рад все линкеры кольца находятся в связанном со10стоянии для глубин ДАМ-потенциала в интервале 10-16 kBT. С уменьшением kDAM наблюдается уменьшение максимального количества связанных линкеров до 3. Следовательно, можно заключить, что кольцо с более гибкими линкерами образует больше связей, чем кольцо сжесткими линкерами, т.к. такому кольцу легче наклониться относительно оси микротрубочки, чтобы образовать больше связей.
Кроме того нашей группой было ранее показано, чтожесткое кольцо с внутренним диаметром, приблизительно равным диаметру микротрубочки, имеет низкое КПД преобразования упругой энергии, запасенной в стенке микротрубочкив механическую работу [Molodtsov 2005b]. А поскольку кольцо с жесткими линкерами (kflex= 2000 kBT/рад) эквивалентно жесткому кольцу с внутренним диаметром равным диаметрумикротрубочки, то можно уже на этой стадии заключить, что конфигурация кольца с жесткими линкерами не является оптимальной.ДАМ-кольцо имеет устойчивое наклонное положение по отношению к оси микротрубочки. Дальнейшие расчеты показали, что для колец с гибкими линкерами kflex = 20 kBT/рад иглубиной ДАМ-потенциала kDAM ~ 12-14 kBT наблюдается совпадение распределения угловнаклона кольца относительно оси микротрубочки с экспериментально померенным [Miranda2005] с достоверностью95%, см.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
