Динитрозильные комплексы железа, S-нитрозотиолы и коэнзим Q как антиоксиданты в системах, моделирующих окислительный стресс (1102912), страница 3
Текст из файла (страница 3)
ед.Рис.4. Кинетики деструкцииДНКЖвусловияхферментативнойгенерациисупероксид-анионрадикала.Реакционная среда содержала:1 − 100 мМ Na,K-фосфатногобуфера pH 7,4, 0,2 мМ 1 мМксантина,0,2ед./млксантиноксидазы,120мкМДНКЖ;2 − то что и (1) плюс 100 мкМметмиоглобина.0скоростьДНКЖ10203040Время, минрезковозрастает (рис.4 кривая 2),однако, этот эффект почти полностью снимается каталазой. ПолученныерезультатыконцентрацииуказываютДНКЖнато,происходитчтокакснижениеподЭПР-детектируемойдействиемO2.-,такигидроксильного радикала, возникающего в условиях эксперимента в реакциимежду Н2О2 и метмиоглобином.Высокая антиоксидантная активность ДНКЖ, позволяет заключить, чтопри взаимодействии этого комплекса NO с O2.-, по-видимому, не происходитобразования пероксинитрита.Пятаяглавапосвященавзаимодействиюбелковыхдинитрозильныхкомплексов с активными формами кислорода.
В разделе 5.1 описаноисследованиевзаимодействиябелковыхДНКЖссупероксидом,ферментативно генерируемым в системе ксантин-ксантиноксидаза. На рис.5и 6 представлены кинетики гибели альбуминовых и гемоглобиновых ДНКЖ,соответственно, под действием супероксида.40033004Сигнал ЭПР, отн.ед.Сигнал ЭПР, отн.ед.5003502502002150400543003220011001500246810012Кинетика деструкции альбуминовыхферментативной генерации супероксида.Рис.5.(1) – Na-фосфатный буфер,альбуминовые ДНКЖ (560µМ), ДТПА(1,6мМ), ксантин (3,5мМ),ксантиноксидоредуктаза(0,6ед./мл);(2) − (1) + СОД (25 ед./мл);(3) − (1) + СОД (400 ед./мл);(4)−кинетикагибелиальбуминовых ДНКЖ в реакционнойсреде без ксантина. Концентрацияальбумина 16,5 мг/мл.вероятным,81216Время, м ин.Время, мин.Представляется4чтои гемоглобиновых ДНКЖ в условияхРис.6.(1) – Na-фосфатный буфер,гемоглобиновые ДНКЖ (540µМ),ДТПА (1,6мМ), ксантин (3,5мМ),ксантиноксидоредуктазу (0,6 ед./мл);(2) − (1) + СОД (100 ед./мл);(3) − (1) + СОД (400 ед./мл);(4) − (2) + каталаза (600 ед./мл);(5)−кинетикаспонтаннойдеструкции гемоглобиновых ДНКЖ вреакционной среде без ксантина.разницавкинетикахгибелиальбуминовых и гемоглобиновых динитрозильных комплексах связана свзаимодействием гема с пероксидом водорода, в результате котороговозникают активные интермедиаты, способные внести свой вклад вдеструкцию гемоглобиновых ДНКЖ.
При взаимодействии пероксидаводорода с гемом образуется феррилгемоглобин, являющийся сильнейшимокислителем. В данных условиях динитрозильные комплексы оказываютсяспособными эффективно восстанавливать феррилгемоглобин, фактическивыступая в роли антиоксидантов. Это может иметь большое значение длятканей с высоким содержанием гемопротеидов, находящихся в условияхокислительного стресса.В разделе 5.2 описано взаимодействие динитрозильных комплексов спероксидом водорода и гидропероксидом трет-бутила. В присутствиипероксидов наблюдалось существенное снижение концентрации ДНКЖ.Было показано, что гидропероксид трет-бутила более эффективно разрушаетгемоглобиновые ДНКЖ.
Это можно объяснить возникновением активныхинтермедиаторов при взаимодействии гема с пероксидом водорода игидропероксидомтрет-бутила.оксоферрилгемоглобин,Такимипротеиновыеинтермедиатамирадикалыявляютсягемоглобинаиалкилперекисные радикалы.В разделе 5.3 описано исследование образования димеров субъединицгемоглобина, образующихся вследствие возникновения дисульфидной связимежду цистеинами β-93 и димеризации тирозиновых свободных радикалов врезультате окислительной модификации. В ходе вызванной пероксидомводорода деструкции гемоглобиновых ДНКЖ можно было бы ожидатьокислениецистеиновыхβ-93,входящихвсоставдинитрозильныхкомплексов, и образования дисульфидной связи. Однако, связанные сгемоглобином ДНКЖ в концентрациях, эквимолярных пероксиду водорода,почти полностью ингибируют димеризацию субъединиц, т.е.
в случае сгемоглобиновыми ДНКЖ не происходит окисления цистеинов молекулыгемоглобина. Причем взаимодействие этих ДНКЖ с пероксидом водорода неприводит к генерации свободных радикалов в реакции Фентоновского типа ивозникновению дисульфидных связей, т.е. железо, входящее в составдинитрозильных комплексов, само по себе, не вызывает разложениеперосида водорода.Таким образом, гемоглобиновые ДНКЖ действуют как антиоксиданты,защищая белок, с которым они связаны, от окислительной модификации.Стоит отметить, что образование белковых ДНКЖ носит обратимыйхарактер и не нарушает функциональной активности белка. Антиоксидантноедействие ДНКЖ, показанное в этом эксперименте, не носит специфическийхарактер по отношению к гемоглобину и также может реализовываться вслучае других белков.
В разделе 5.4 описано исследование взаимодействияальбуминовых и гемоглобиновых ДНКЖ с пероксинитритом. В результатедиффузионно-контролируемойреакциисупероксидасоксидомазотаобразуется один из наиболее мощных биологических окислителей −пероксинитрит. Невысокие концентрации оксида азота и супероксидакомпенсируются высокой константой скорости реакции. Представляетсявероятным, что пероксинитрит может вызывать окислительную деструкциюбелковых ДНКЖ, как в физиологических условиях, так и в модельныхсистемах.Рис.7. Деструкция альбуминовыхДНКЖ под действием различныхконцентраций пероксинитрита вNa-фосфатном буфере (0,2 М, pH7,4), содержащем ДТПА (1,6 мМ).Концентрация альбумина 16,5мг/мл.Концентрацияальбуминовых ДНКЖ (560 µМ).Сигнал ЭПР, отн.ед.4003002001000 ,0На рис.7 и 8 представлены0 ,20 ,40 ,60 ,8-[O N O O ], м Мкривые зависимости деструкцииальбуминовых и гемоглобиновых ДНКЖ от концентрации пероксинитрита.600Рис.8.
Деструкция гемоглобиновыхДНКЖ под действием различныхконцентраций пероксинитрита в Naфосфатном буфере (0,2 М, pH 7,4),содержащемДТПА(1,6мМ).Концентрация гемоглобина 16,3 мг/мл(288µМ).Концентрациягемоглобиновых ДНКЖ (540 µМ).Сигнал ЭПР, отн.ед.500400300200100Хорошо видно, что альбуминовые00123456-[O N O O ], мМДНКЖ почти на порядок болеечувствительныкдействиюпероксинитрита, чем ДНКЖ, ассоциированные с гемоглобином. Этот фактможет быть связан как с большей доступностью альбуминовых ДНКЖ, так ис возможным взаимодействием пероксинитрита с гемом этих белковыхмолекул. Интересно, что перелом в концентрационной зависимостидеструкции гемоглобиновых ДНКЖ соответствует молярному соотношениюгем/ONOO−, равному 2.
Это косвенно подтверждает предположение, чтоименногеммыβ-субъединицгемоглобиначастичнонейтрализуютпероксинитрит.Шестаяглавапосвященаописаниювзаимодействияоксофферилмиоглобина с динитрозильными комплексами. Известно, что вдеструктивных процессах, развивающихся в ходе окислительного стресса,определенную роль играют миоглобин, гемоглобин и другие гемопротеиды.В реакциях между гемопротеидами и органическими гидропероксидамивозникают алкоксильные и алкилпероксильные радикалы, являющиесяинтермедиатами свободнорадикального окисления липидов. С другойстороны, при взаимодействии перекиси водорода или органическихгидропероксидов с гемопротеидами образуется оксоферрилгем (порфирин-FeIV=O),такжеспособныйвызыватьокислительнуюмодификациюбиологически важных молекул.
В ряде работ показано, что оксид азота (NO)снижаетпрооксидантноедействиеоксоферрилгемопротеидовивосстанавливает их до ферриформы (порфирин-FeШ).Образованиеоксоферрилмиоглобина,наблюдалосьвсистемесодержащей метмиоглобин и гидропероксид трет-бутила. Восстановлениеоксоферрилмиоглобина сопровождалось быстрым снижением концентрацииДНКЖ, которая контролировалась по характерному для динитрозильныхкомплексов железа сигналу ЭПР (Рис.9).Рис.9. Кинетика деструкция 0,15 мМДНКЖ (по изменению сигнала ЭПР)в процессе инкубации с 0,1 мМметмиоглобином в присутствии 0,4мМ гидропероксида трет-бутила.Перед регистрацией спектров ЭПР кобразцам добавляли 4 мМ цистеин.сигнал ЭПР ДНКЖ, отн.
ед.1000800600400200005101520Время, минЭтот факт согласуется свыдвинутым нами предположением о способности ДНКЖ взаимодействоватьс органическими свободными радикалами и оксоферрилмиоглобином.В модельной системе, содержащей гидропероксид трет-бутила иметмиоглобин, весьма сложно было установить вклад в деструкцию ДНКЖсвободных радикалов с одной стороны и оксоферрилформы миоглобина сдругой. Для определения этого вклада мы исследовали влияние на ДНКЖтолькооксоферрилмиоглобина.Последнийполучаливреакцииметмиоглобина и Н2О2, избыток которой удалялся каталазой. ВзаимодействиеДНКЖ с оксоферрилмиоглобином действительно вызывало деструкциюисследуемыхкомплексов,причемэтотпроцесссопровождалсявосстановлением оксоферрилгема до его метформы, однако это снижениебыло не столь значительно как в системах содержащих гидропероксид третбутила.
Исходя из этого мы полагаем, что одной из важных функцийнитрозильныхкомплексовжелезаinvivoявляетсядетоксикацияобразующихся при окислительном стрессе оксоферрилформ гемопротеидов.В седьмой глава описано исследование взаимодействия убихинола иGSNO в условиях моделирующих окислительный стресс. Известно, что входе свободнорадикального окисления биологических мембран происходитбыстроеснижениеконцентрацийлипофильныхантиоксидантов. Приинтенсивной генерации свободных радикалов возможна окислительнаядеструкция молекул этих антиоксидантов.
В связи с этим, наиболееобъективным параметром оценки влияния окислительного стресса на белоклипидные комплексы является измерение концентрации липофильныхантиоксидантов.окисленияПриизучениисвободнорадикальногогомогенатамиокардакрысконцентрацииинициировалосьразличныхформгидропероксидоммыубихинона.трет-бутила.перекисногооценивалиизменениеПерекисноеокислениеБылопоказано,чтодеструкцию убихинона хорошо ингибирует S-нитрозоглутатион. Защитноедействие GSNO в ходе перекисного окисления гомогената согласуется свысокой антиоксидантной эффективностью производных оксида азота,содержащих катион нитрозония, продемонстрированных нами в другихмодельных системах.Взаключенииподведеныдиссертационной работы.итогиисформулированывыводыВЫВОДЫ1. В системе содержащей гемопротеиды в сочетании с H2O2 илигидропероксидом трет-бутила, а также в условиях генерациисупероксидногоанион-радикалапроисходитбыстрыйраспаднизкомолекулярных и белковых динитрозильных комплексов железа.2.Обнаружено,чтоассоциированныединитрозильныекомплексыгемопротеидокислительнойотжелезасмогутгемоглобиномзащищатьмодификацииподэтотдействиемперекиси водорода.3.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
