Динитрозильные комплексы железа, S-нитрозотиолы и коэнзим Q как антиоксиданты в системах, моделирующих окислительный стресс (1102912), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Кратко изложеныосновные физико-химические свойства активных форм кислорода и азота.Описаны их источники в биологических системах. Дана классификация NOсинтаз и представление о их функционировании, способах регуляцииферментативной активности. Кратко изложена работа дыхательной цепимитохондрий с упором на образование ею активных форм кислорода, преждевсего супероксида. Описана ксантиноксидоредуктаза, даны ее основныефункции и регуляция.
В разделе 1.3 кратко описано современноепредставление о взаимодействии активных форм кислорода и азота в клетке,рассказано о роли динитрозильных комплексов в этом взаимодействии.Отдельный раздел посвящен пероксинитриту, как одному из наиболееважных продуктов взаимодействия активных форм кислорода и азота,описаны его цитотаксические свойства. Заканчивает главу раздел 1.4 опрооксидантных и антиоксидантных свойствах активных форм кислорода иазота, обобщаются данные о роли динитрозильных комплексов и Sнитрозоглутатиона.
Целью обзора литературы было не только показатьсовременное представление о разделе биофизики посвященном свободнымрадикалам кислорода и азота, но и показать место данной работы в этомразделе, обосновать актуальность поставленных в ней задач.Во второй главе представлены материалы и методы исследования.Раздел2.1посвященрегистрацииспектровЭПР.СпектрыЭПРрегистрировали на спектрометре E-109Е фирмы Varian (США), прикомнатной температуре (~25°C). Условия регистрации спектров ЭПР: СВЧмощность 5 мВт, СВ частота 9,15 ГГц, амплитуда ВЧ модуляции 0,05 мТлдля TIRON и СВЧ мощность 10 мВт, амплитуда ВЧ модуляции 0,4 мТл дляДНКЖ. Спектры феноксильного радикала пробукола регистрировали приСВЧ мощности 50 мВт. В экспериментах с генерацией О2•-, для постоянствагазового состава образцы помещали в тонкостенный (толщина стенок0,00254 мм) тефлоновый капилляр фирмы Norell, Inc.
(США), а записьспектров проводили при непрерывной продувке воздухом. В остальныхслучаях образцы помешались в стеклянные капилляры. Для определенияскорости генерации свободных радикалов кислорода митохондриямииспользовали спиновую ловушку TIRON. В остальных случаях дляопределенияскоростигенерациирадикаловкислородаиспользовалиспиновуюловушкуDEPMPO.Регистрациюспектровспин-аддуктовDEPMPO проводили при тех же условиях что и для ДНКЖ: СВЧ мощность 5мВт, СВ частота 9,15 ГГц, амплитуда ВЧ модуляции 0,1 мТл. В разделе 2.2описывается получение препаратов и работа с ними. В работе использоваливосстановленный глутатион (Calbiochem, США), цистеин, гидропероксидтрет-бутила(Merk,Германия),пероксидводорода,ДТПА,ЭДТА(этилендиаминтетрауксусная кислота), DEPMPO (5-диэтоксифосфорил-5метил-1-пирролин N-оксид) (OXIS, США), TIRON (4,5 - диоксибензол - 1,3 дисульфат натрия), супероксиддисмутазу, ксантиноксидазу, гемоглобин,метмиоглобин, гемин, пероксинитрит, диоксид калия (KO2), убихинон,ферритин и 2-тиобарбитуровую кислоту (Sigma, США) и некоторые другие.S-нитрозоглутатион (GSNO) и динитрозильные комплексы железа (ДНКЖ) сглутатионом в диамагнитной димерной форме получали, смешивая 300 мМNaNO2 и 200 мМ восстановленного глутатиона в кислой среде или растворыFeSO4 и глутатиона в молярном соотношении 1:2 сосуде Тунберга ватмосфере NO, соответственно.
Препараты GSNO, ONOO- и ДНКЖ хранилипри –20οС. Концентрацию ДНКЖ определяли методом спектроскопии ЭПР.Для генерации супероксида в разных экспериментах использовали системуксантин-ксантиноксидаза или супероксид калия (КО2). При работе сксантиноксидазай образец помещали в тонкостенный (толщина стенок0,00254 мм) тефлоновый капилляр, как и при работе с митохондриями, азаписьспектровпроводилипринепрерывнойпродувкевоздухом.Пероксинитрит получали, смешивая охлажденные растворы 1 М NaNO2 и 1М Н2О2 в 0,3 М H2SO4, после чего быстро добавляли равный объём 1,4 МNaOН. Разделы 2.3 и 2.4 посвящены описанию получения изолированныхмитохондрий и определению их функциональной активности.
Митохондриивыделяли из сердец крыс. Методика выделения митохондрий быластандартной. Животных усыпляли, используя 20% раствор уретана (1,8 мг/кгмассы животного), который вводился в брюшную полость. Затем быстроизвлекали сердце и помещали в охлажденную (4οС) среду выделения. Cоставсредывыделения:300мMсахароза,10мMгидроксиэтилпиперазин-N-2-этансульфоноваякислота),(этилендиаминтетрауксусная7.4.кислота);рНHEPES0,5(N-2-мMEDTAИзмельченнуютканьпереносили в гомогенизатор (стекло-тефлон), добавляли 25-30 мл средывыделения в соответствии с соотношением 1:8 и гомогенизировали 2-3минуты до превращения суспензии в гомогенную.
Осаждение митохондрийпроизводили в два этапа на центрифуге К-24 (ГДР). Полученный осадокмитохондрий суспендировали в 150 мл БСА. Далее помещали в маленькуюпробирку и хранили во льду или замораживая при –20°С. Концентрациябелка в митохондриальной суспензии, определенная по биуретовому методу,составляла 30-35 мг/мл. Раздел 2.5 посвящен описанию инициированияперекисногоокислениямитохондрийиметодуопределенияМДА.Свободнорадикальное окисление митохондрий индуцировали добавлением400 мкМ гидропероксида трет-бутила и 100 мкМ метмиоглобина.
В рядеэкспериментов вместо метмиоглобина или совместно с ним добавлялиферритин (2,5 мг/мл). Образцы объемом в 1 мл инкубировались в течение 2часов при 37°С после чего в них определялось содержание малоновогодиальдегида (МДА). Для этого к 0,5 мл инкубационной смеси, содержащейпрепарат митохондрий, добавляли 1,5 мл 1%-ной фосфорной кислоты, 10-4М ЭДТА, 10-5 М ВНТ и 1 мл 0,5%-ного раствора 2-тиобарбитуровой кислоты(ТБК), после чего инкубировали 45 мин при 100°С. После охлаждения смеси,комплекс МДА с ТБК экстрагировали н-бутанолом. В бутанольной фазерегистрировали спектр поглощения в области 515-550 нм.
Концентрацию МДАрассчитывали по оптической плотности комплексов МДА-ТБК при 532 нм (ε532=1,56.105 М-1 см-1) [92]. Все оптические измерения проводили наспектрофотометрах Hitachi 557 (Япония) иBeckman Coulter ∆ 650 (США). При исследовании взаимодействияДНКЖ с супероксидным радикалом (О2•–), последний генерировалидобавлениемкреакционнойсмесисвежеприготовленногорастворасупероксида калия (КО2) в диметилсульфоксиде или использовали системуксантин-ксантиноксидаза для ферментативной генерации О2•–.В третьей и последующих главах представлены непосредственнорезультатыисследований. Третьяглава посвященавзаимодействиюнизкомолекулярных динитрозильных комплексов с активными формамикислородаигидропероксидами.Вданнойработефактгенерациисупероксидных радикалов митохондриями устанавливали при помощи спиновойловушки TIRON.
При инкубации митохондрий в присутствии субстратовдыхательной цепи не происходит существенного образования супероксида. Придобавлении антимицина появляется сигнал аддукта спиновой ловушки ссупероксидным радикалом. На рис.1 показана деструкция ДНКЖ при ихинкубации с митохондриями из сердечной мышцы крыс в присутствиисукцината в качестве субстрата и антимицина А.1000800Сигнал ЭПР, отн.
ед.Рис.1. Деструкция динитрозильныхкомплексовсглутатионовымилигандами при генерации супероксидамитохондриями из сердца крысы.1 – инкубационная среда + 0,2 мМДНКЖ + 1 мкг/мл антимицина А + 5мМ сукцината;2 − то же что и (1) + СОД (150ед/мл) + каталаза (400 ед/мл).2600400120000481216В рем я, м инВ случае добавления в системусупероксиддисмутазы и каталазы, не происходило столь значительногопадения сигнала, т.е. деструкцию динитрозильных комплексов вызываетименно супероксид, генерируемый дыхательной цепью митохондрий.Значительное падение сигнала динитрозильных комплексов говорит овысокой скорости реакции между ними и супероксидным радикалом.Антиоксидантное действие ДНКЖ оценивали по ингибированию образования всистеме гемин/H2O2 феноксильного радикала пробукола.
Последний являетсясинтетическим антиоксидантом близким по структуре и механизму действия к αтокоферолу. Из рис.2 видно, что ДНКЖ как с глутатионовыми так и сцистеиновыми лигандами (спектры 2 и 3), в молярных соотношениях, сравнимыхс H2O2 и гемином, более чем на 70% ингибируют образование радикалапробукола. Динитрозильные комплексы с фосфатными лигандами были несколькоменее эффективны (~50% ингибирования) (рис.2, спектр 4).Рис.2. Влияние динитрозильныхкомплексовсразличнымилигандаминаобразованиерадикала пробукола.
Реакционнаясмесьсодержала:изопропанол/K,Na-фосфатныйбуфер, 1,5 мМ пробукола и 0,25мМ гемина.1 − cпектр ЭПР феноксильногорадикала пробуколаобразовавшегося после добавленияв реакционную среду 2 мМ Н2О2;2 − то же что и (1) + 0,5 мМДНКЖ, содержащих цистеин;3 − то же что и (1) + 0,5 мМДНКЖ, содержащих глутатион;4 − то же что и (1) + 0,5 мМДНКЖ с фосфат-анионом вкачестве лиганда.g=2,0031234324325326327328329М агнитное поле, мТлТаким образом, можно предположить, что тиольные лиганды наряду сдругими компонентами динитрозильных комплексов, такими как NO+ и ионыжелеза, вносят свой вклад в снижение концентрации радикала пробукола.Образование феноксильного радикала может происходить при одноэлектронномокислениипробуколаоксоферрилформойгеминаилигидроксильнымрадикалом (рис.2).
Представляется вероятным, что эти активные окислители,образуются при взаимодействии гемина с H2O2.Четвертая глава посвящена ферритину и миоглобину, их участию вразвитии окислительного стресса. В литературе появляется все больше данныхо связи метаболизма ферритина, активных форм кислорода и NO. Так,ферритин может участвовать в образовании нитрозильных комплексов железа.Синтез самого ферритина регулируется оксидом азота, а проходящая сучастием ферритина, микросомальная продукция активных форм кислорода,ингибируется донорами NO. В то же время, возможное влияние миоглобина иферритинанаокислительнуюмодификациюмитохондрийизученонедостаточно. В данной работе было исследовано свободнорадикальноеокисление митохондрий, индуцированное сочетанием гидропероксида третбутила с метмиоглобином или их комбинацией с ферритином.
На рис.3представлены результаты изучения влияния S-нитрозоглутатиона (GSNO), GSHи ДНКЖ на образование вторичных продуктов перекисного окисления (МДА) впрепарате митохондрий из миокарда крысы.1,6МДА, мкMРис.3. Накопление МДА.1 - препарат митохондрий (0,5 мгбелка/мл), Na,K-фосфатный буфер и400 мкМ гидропероксида трет-бутила;2 – то же, что и (1) плюс 100 мкМметмиоглобина;3 - то же, что и (2) плюс 100 мкМGSNO;4 - то же, что и (2) плюс 200 мкМGSH;5 - то же, что и (2) плюс 100 мкМGSNO и 200 мкМ GSH;6 - то же, что и (2) плюс 50 мкМДНКЖ.В серии параллельных экспериментовв среду инкубации добавляли 2,5мкг/мл ферритина (заштрихованныестолбики).1,20,80,40,0123456Образование МДА наиболееэффективно подавлялось под действием ДНКЖ (рис.3 столбец 6), а такжепри сочетанном действии GSNO и GSH (рис.3 столбец 5). Следует отметить,что в последнем случае возможно формирование ДНКЖ при взаимодействииGSNO, GSH и ионов железа, содержащихся в реакционной среде. НакоплениеМДА при окислении мембран митохондрий индуцированном гидропероксидомтрет-бутила в сочетании с метмиоглобином и ферритином было достоверно выше,чем в присутствии гидропероксида трет-бутила и миоглобина (рис.3 столбец 2).Нарис.4представленыкинетикидеструкцииДНКЖприферментативной генерации O2.- в системе ксантин - ксантиноксидаза.1200В100080060040012002присутствииметмиоглобинараспадаСигнал ЭПР, отн.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
