Карбоксилсодержащие полимерные микросферы для изучения трехмерного строения сосудистого русла экспериментальных животных (1091668), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Видно, что полученные полимерныемикросферы имеют узкое РЧР (рис.12).Рисунок12.Микрофотографияигистограмма распределениячастицпоразмерамполистирольной суспензии,полученнойзатравочнойполимеризацией3.5. Разработка метода анализа 3-х мерной организации сосудистого руслас помощью полимерных микросферОсновным методом исследования сосудистого русла предполагаетсяиспользовать флуоресцентную конфокальную микроскопию, что требуетзаполнения сосудов окрашенными флуоресцентным красителем полимернымимикросферами.Окрашивание полимерных микросфер флуоресцентным красителемпроводили по описанной в патентах методике. В качестве красителя былвыбран магдаловый красный.
Полимерные микросферы набухали в ацетоне, вкотором растворен краситель требуемой концентрации.Вначале были определены пороговые концентрации красителя с достаточнымоткликом флуоресценции. Для полистирольных и полиметилметакрилатныхсуспензий пороговая концентрация красителя составляет 0,1 – 0,2%об.После окрашивания изучали агрегативную устойчивость полимерныхсуспензий в физиологических средах для того, чтобы исключить агрегациюмикросфер и, как следствие, закупорку сосудов агрегатами при перфузии. Дляприменения были пригодны полимерные микросферы, устойчивые в раствореэлектролита (NaCl) с концентрацией не менее 0,15 М.
Все полимерныесуспензии характеризовались устойчивостью в физиологических растворах.Таблица 9. Агрегативная устойчивость микросфер в различных средах.ПСПММАNaCl 0,15 МПоливидонСтабизол++++-Фруктоза(10%р-р)++Сахароза(2,6%р-р)++Наряду с изучением агрегативной устойчивости полимерных микросфер врастворах электролитов было проведено изучение агрегативной устойчивостимикросфер в различных растворах, применяющихся в медицине для замещениякровопотери при внутривенном переливании крови.
Оказалось, чтополистирольные и полиметилметакрилатные микросферы устойчивы врастворах поливидона, 10%-ном растворе фруктозы и 2,6%-ном растворесахарозы (таблица 9). Данные растворы могут служить вариантом выбора припроведенииэкспериментовпозаполнениюсосудистогоруслаэкспериментальных животных полимерными микросферами.17Окрашенные полимерные микросферы использовали для заполнениясосудистого русла крыс. Для анализа были выбраны фрагменты брыжейки тонкогокишечника.Перед анализом в световом микроскопе препараты просветлялись путемплавного перевода через серию водных растворов фруктозы с восходящейконцентрацией. Эта методика была выбрана, поскольку краситель, магдаловыйкрасный, практически не растворим в воде. Препараты пропитывали фруктозой(показатель преломления 80%-ного раствора фруктозы n=1,49, который близок кпоказателю преломления неокрашенных тканей экспериментальных животных).Фотографии были выполнены с помощью светового микроскопа.Результаты просветления показаны на рисунке 13.На микрофотографии 13 А представлен фрагмент микрососудистого русла,заполненного микросферами диаметром 6 мкм, окрашенными магдаловымкрасным.
Четко видны микросферы и хорошо видно, что микрососуд (1) имеетнесколько ветвей (2,3,4), 2 из которых (2 и 4) находятся не в фокусе и выглядятразмытыми. Внутри просвета ветви (3) микросферы расположены в один ряд,ветвь заполнена на расстояние 24 мкм. Вероятно, дальнейшее продвижениемикросфер по этой ветви было остановлено наличием сужения. Размытыелинии (5) на микрофотографии являются границами жировых клеток.Рисунок 13. Кровеносные сосуды брыжейки крысы, заполненные микросферами диаметром6 мкм (А) и микросферами диаметром 0,4 мкм (Б).Видно, что полимерные микросферы плотно заполнили сосудистое русло иостанавливаются в том месте, где внутренний диаметр сосуда становитсяменьше диаметра микросфер.
Следовательно, данный подход позволяетанализировать артериальную часть сосудистого русла. В сосудистом руслесуществуют «шунты», позволяющие крови, минуя капилляры попадать ввенозное русло, и диаметр которых сопоставим с диаметром артерий. Поэтомуне исключается возможность попадания микросфер диаметром 6 мкм ввенозное русло. Однако, в тех участках, где мы проводили исследования, вен,заполненных микросферами, обнаружено не было.
Но это необходимо приниматьво внимание при дальнейших исследованиях.На микрофотографии 13 Б представлен фрагмент микрососудистого русла,заполненного микросферами диаметром 0,4 мкм, окрашенными магдаловым18красным. Четко виден сосуд (1), имеющий 2 ответвления (2 и 3). Хорошо видно,что сосуд заполнен окрашенными микросферами.Просветленныепрепараты,заполненныеполиметилметакрилатнымимикросферами с диаметром частиц 0,4мкм и полистирольными микросферами сдиаметром частиц 6мкм, окрашенными флуоресцентным красителем, магдаловымкрасным, исследовались на конфокальном микроскопе Nikon Eclipse C1 plus.На микрофотографии 14 Б представлен фрагмент микрососудистого русла,заполненного микросферами диаметром 0,4 мкм, окрашенными магдаловымкрасным. Виден раздваивающийся сосуд (1), плотно заполненныймикросферами, и вена (2).Рисунок 14.
Микрососуды брыжейки крысы. А - капилляр (заполнен суспензией с размеромчастиц 6 мкм); Б – артериола (1) и венула (2) (заполнены суспензией с размером частиц 0,4мкм); В – артериола (заполнена суспензией с размером частиц 0,4 мкм).На микрофотографии 14 В видна артериола (1), от которой вправо и влевоотходят 4 ветви. Ветви (2) и (3) делятся на капилляры со средним диаметром 4 мкм.Интенсивность флуоресценции артериолы (1) в левом верхнем углу фотографиименьше, чем по всей длине артериолы, что говорит о том, что эта часть артериолынаходится выше плоскости оптического среза (4).Для селективного анализа сосудов разного диаметра необходимо использоватьнабор полимерных микросфер разного размера.
В качестве примера, намикрофотографии 14 А показано заполнение капилляра микросферами с размером6 мкм. Это позволит анализировать полную картину 3-х мерного ветвления сосудовв процессе ангиогенеза в условиях нормы и патологии.Была выполнена серия оптических срезов (ОС) препарата (рис.15),заполненного полиметилметакрилатными микросферами с диаметром 0,4 мкм.Оптические срезы были сделаны через каждые 25 мкм по глубине препарата отповерхности до основания. Исследуемый препарат имел толщину 275 мкм.Полученные данные дают возможность определить плотность (количество)сосудов в объеме препарата с помощью программы ImageJ. В этой программеесть возможность сделать проекцию всех ОС на основание препарата по схеме,приведенной на рисунке 16.
Из полученного изображения (рис.17) возможноопределить площадь сосудов в препарате и, зная толщину препарата,представляется возможным рассчитать количество сосудов в его объеме.191.Поверхность преперата2. ОС на глубине 25 мкм3. ОС на глубине 50 мкм4. ОС на глубине 75 мкм5. ОС на глубине 100 мкм6. ОС на глубине 125 мкм7.ОС на глубине 150 мкм8. ОС на глубине 175 мкм9. ОС на глубине 200 мкм10.
ОС на глубине 225 мкм11. ОС на глубине 250 мкм12. ОС на глубине 275 мкмРисунок 15. Серия оптических срезов (ОС), сделанных на расстоянии 25 мкм друг от другапо глубине препарата.Таким образом, была разработана методика анализа сосудов, основнымпреимуществом которой является возможность построения трехмерной модели,позволяющей проанализировать плотность (количество) сосудов в объемепрепарата, а так же определить их пространственное положение.20Рисунок 16. Схема полученияпроекции всех оптических срезовпрепарата.Рисунок 17. Проекция оптическихсрезовпрепарата,наплоскостьпараллельную основанию препарата.Полученные полимерные микросферы характеризуются высокойстабильностью во времени, наличием карбоксильных групп на поверхности,агрегативной устойчивостью в растворах электролитов. Эти свойствапозволяют использовать при создании иммунодиагностических тест-систем.Синтезированные полимерные микросферы были переданы дляиспытаний в институт физико-химической медицины, где на их основе былиразработаны модельные тест-системы, которые показали высокуюспецифичность и чувствительность.
Полученные результаты позволяютрекомендовать данные полимерные микросферы для создания различных тестсистем медицинского назначения.ВЫВОДЫ:1.Синтезированы карбоксилсодержащие полимерные микросферыразличной природы с диаметрами частиц в интервале 0,3 – 1,6 мкм и 6,2мкм с узким распределением по размерам, и на их основе созданаметодика анализа архитектуры сосудистого русла.2.Для создания метода анализа структуры сосудистого русла с различнымдиаметром синтезированы полимерные суспензии трех типов:полистиролметакриловые, полистирольные и полиметилметакрилатные.21Все полимерные суспензии имели узкое распределение по диаметрам, несодержали ассоциатов, были устойчивы в буферных растворах и прихранении.3.Впервые в качестве ПАВ для синтеза полистирольных иполиметилметакрилатныхсуспензийиспользованновыйтипкремнийорганическогофункциональногоПАВα,ω–бис[10карбоксидецил]полидиметилсилоксан.Изученыегоколлоиднохимические свойства.4.Предложен новый подход к созданию методики анализа сосудов,позволяющий с помощью конфокальной микроскопии построитьтрехмерную модель сосудистого русла.5.На примере полистирольных микросфер с диаметром 6 мкм,окрашенными люминесцентным красителем, показана возможность спомощьюконфокальноймикроскопииувидетьархитектуруартериального русла.6.Полученные полимерные микросферы были рекомендованысоздания диагностических тест-систем медицинского назначения.дляСписок печатных работ:Статьи, опубликованные в журналах ВАК:1.
ГрицковаИ.А.Полимеризациястиролавприсутствиикремнийорганических ПАВ различной природы / И.А. Грицкова, Е.Н.Левшенко, Е.Р. Мансурова, И.В. Хачатурян, Н.И. Прокопов, Г.А. Симакова,В.М. Копылов // Вестник МИТХТ. – 2008. – Т. 3. – №5. – С. 111-114.2. Грицкова И.А.
Полимеризация стирола в присутствии поверхностноактивных кремнийорганических веществ различной природы / И.А.Грицкова, В.М. Копылов, Г.А. Симакова, С.А. Гусев, И.Ю. Маркузе, Е.Н.Левшенко // Высокомолекулярные соединения. – 2010. – серия А. – Т. 52. –№7. – С.1-7.3. Волкова Е.В. Полимеризация метилметакрилата в присутствиикремнийорганических ПАВ / Е.В. Волкова, И.А. Грицкова, Л.А. Злыднева,Е.Н.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
