ФДТПЛ04 (1060280), страница 3

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 3)

Д =  lg T (3)

Величина Д меняется в пределах от 0 (Т = 1) до  (Т = 0), однако фактическая возможность измерения Д определяется ценой деления шкалы. Так, при Т =0,1 Д = 1;при Т = 0,01 Д = 2; производить измерения с точностью, превы-

Р

ис. 7. Геометрия эритроцита в различных условиях: а) в изотоническом растворе, б) при осмотическом давлении 217 мОсм/л, в) при осмотическом давлении 130 мОсм/л.

шающей 1% по Т, нереально, причем при малых пропусканиях (Т  10%) ошибка резко возрастает. Поэтому реальным диапазоном измерения Д является 0  Д  2. По этой причине фактическая возможность абсолютного измерения концентрации исследуемого вещества по оптической плотности, в соответствии с формулой Ламберта-Бера

Д = сL (4)

где с – концентрация,  - коэффициент молярной экстинкции, L – толщина образца (длина оптического пути излучения в испытуемой среде), затруднена. Однако относительная концентрация выживших частиц в зависимости от времени облучения t и дозы облучения D, имеющей смысл суммарной падающей на исследуемый пул клеток энергии излучения, может быть найдена на основе предложенной в МГУ им. М.В. Ломоносова [3] и развитой в МГТУ им. Н.Э. Баумана математической модели (см. приложение 1). Простейший вариант этой модели основан на предположениях о пренебрежении репаративными процессами, преобладании химического механизма тушения, отсутствии кислородного голодания и определении доли выживших клеток сразу после прекращения облучения. Результатом расчета при таких предположениях будет следующая зависимость относительной концентрации от дозы:

(5)

Здесь обозначено  t = D – доза воздействующего излучения, - постоянная, характеризующая скорость гибели сенсибилизированных клеток в начальный момент облучения. Найденная зависимость (5), будучи построенной в координатах ( ), и называется дозовой кривой. Коэффициент характеризует крутизну этой кривой (см. приложение 1). В виде дозовой кривой можно представить и экспериментальные данные. Пример дозовой кривой приведён на рис. 9. Поскольку в дозовую кривую (5), определяющую зависимость ln от дозы облучения, входит не абсолютная концентрация сенсибилизированных частиц, а относительная, приводить в соответствие измеряемую оптическую плотность Д с абсолютной молярной концентрацией с нет необходимости, тем более, что коэффициент молярной экстинкции  априори неизвестен.

Рис.8. Схема экспериментальная установки для наблюдения ФДЭ на взвеси эритроцитов: 1 – источник света, 2 – конденсор, 3.6.8 – диафрагмы; 4 – коллиматор; 5 – сменные интерференционные фильтры; 7 – кювета с исследуемой жидкостью; 9 – светоделительная пластинка; 10 – фотодиод; 11 – фотоэлемент; 12 – усилитель постоянного тока; 13 – измерительный прибор.

Рис.9. Расчётные дозовые кривые в предположении о преобладании химического механизма тушения.

Правильное построение дозовых кривых для ФДЭ должно содержать: а) выбор концентрации эритроцитов в суспензии в соответствии с исходным пропусканием образца в пределах Т = 2030%, чтобы диапазон изменения пропускания при гемолизе эритроцитов был велик по сравнению с исходной величиной пропускания; б) выбор концентрации ФС, достаточно большой для обеспечения полного поражения всех эритроцитов в образце, но при этом достаточно малой для того, чтобы исходное пропускание образца с добавленным ФС не сильно отличалось от несенсибилизированного (т.е. находилось в пределах тех же 2030%); в) обязательное измерение характеристик контрольного образца, выдерживаемого параллельно с облучаемым в темноте, с тем, чтобы выделять при каждом измерении ту оптическую плотность, которая определяется именно ФДЭ, а не всеми прочими причинами. Основной серии измерений, позволяющих построить дозовую кривую, должны предшествовать 2 серии предварительных измерений: а) спектральной характеристики пропускания суспензии эритроцитов (несенсибилизированной); б) спектральной характеристики пропускания раствора ФС. Эти кривые позволяют определить как предпочтительную длину волны источника засветки, так и длину волны, на которой следует вести измерения Т и Д для наиболее заметного проявления ФДЭ. Очевидно, что первая должна быть близка к максимуму поглощения ФС, вторая – к максимуму экстинкции суспензии эритроцитов. Доза облучения (в относительных единицах) определяется посредством измерения времени облучения. В качестве контрольного, как в начале, так и по окончании опыта, следует провести измерение плотности потока излучения (освещенности), даваемой используемым источником. Это необходимо для того, чтобы можно было считать зависимость дозы D облучения от времени t линейной (обеспечение линейности, согласно формулам (13) и (5), имеет место только при I₀ = const).

Выполнение работы.

7. Используемое оборудование и материалы.

1. Колориметр фотоэлектрический КФК-2.

2. Источники света: осветитель эндоскопический ОС-150 со световодным кабелем; светодиодная матрица с набором светодиодов, излучающих в красной области спектра; коллимированный источник света на базе лампы накаливания, используемый в микроскопии и для экспериментов на оптической скамье.

3. Люксметр (любой из выпускаемых промышленно, имеющий диапазон измерения освещенностей до 10⁵ лк).

4. Микроскоп лабораторный с увеличением порядка 400-500 (безыммерсионный).

5. Штатив для установки образцов в процессе облучения или оптический столик из комплекта оптической скамьи.

6. Прямоугольные кюветы, пробирки, пипетки, протирочный материал (тонкая ткань, вата), спирт.

7. Физиологический раствор.

8. Фотосенсибилизаторы (ФОТОГЕМ, ФОТОСЕНС).

9. Ингибитор: гипосульфит (тиосульфат) натрия, в кристаллах.

10. Образцы крови (предлагаются преподавателем для исследования на основании лабораторных анализов поликлиники).

11. Дистиллированная вода.

Примечание: для исследования преподавателем может быть предложен новый тип ФС или ингибитора, а также различные образцы крови.

Приложение к работе содержит, кроме описания и математической модели, правила порядка эксплуатации приборов и оборудования и методику работы с биологическими препаратами.

8. Порядок выполнения работы.

1. Изучить описание методики измерений, проанализировать схему эксперимента и порядок работы с измерительной аппаратурой (колориметр, люксметр, микроскоп, источник излучения).

2. Подготовить ответы на контрольные вопросы.

3. Приготовить растворы ФС в дистиллированной воде, снять необходимые характеристики пропускания растворов с помощью колориметра (Т = 6070%). Поместить заготовленные растворы в темноту.

4. Приготовить суспензию эритроцитов нужной концентрации путем разбавления предложенного образца крови физраствором (Т = 2030%). Предпочтительнее использовать кровь с введенными консервантами (гепарин и др.) для повышения стабильности ее оптических характеристик. Снять спектральную характеристику пропускания приготовленной суспензии и выделить оптимальную длину волны для наблюдения ожидаемого ФДЭ.

5. Приготовить с каждым из ФС не менее 3 проб (контрольная – темновая, 2 пробы ФС + эритроциты (одна проба облучается сразу, другая после инкубации), ФС + эритроциты + ингибитор). Зафиксировать время приготовления одной из проб ФС+эритроциты для дальнейшего подсчёта времени инкубации. Инкубация проводится для накопления ФС в клетке. Время инкубации ФС ФОТОГЕМ должно составлять не менее получаса ФС ФОТОСЕНС - около часа. Поместить все образцы в темное место (лабораторный шкаф).

6. Измерить начальную плотность всех проб с помощью колориметра.

7. Произвести визуальный контроль всех проб с помощью микроскопа. Зарисовать результаты наблюдений с указанием характерных размеров эритроцитов и других наблюдаемых микрообъектов.

8. Измерить плотность потока выбранного источника излучения. Начать облучение одного из образцов ФС + эритроциты, выбрав время облучения перед первым измерением не более 0,5 минут. Производить измерения оптической плотности и пропускания образцов после каждого облучения, постоянно держа необлучаемые в данный момент образцы в темноте. При каждом измерении производить визуальный контроль состояния эритроцитов через микроскоп. Каждое измерение должно быть выполнено не менее 5 раз для расчёта среднего значения и среднеквадратичной ошибки измерения. При появлении эффекта (изменении оптической плотности образца) измерения вести каждую минуту. После окончания серии измерений (выхода на плато оптической плотности) произвести повторный контроль освещенности. Данные измерений занести в таблицу.

9. Сравнить полученные экспериментальные результаты с теоретической зависимостью, рассчитанной по формуле (5). Построить графики всех полученных экспериментальных кривых.

10. Выполнить пункты 4 - 8 с каждым из предложенных преподавателем ФС. Оценить по данным измерений дозу облучения, полученную каждым из облученных образцов.

11. Составить описание проделанных согласно п.3-10 действий и анализ полученных результатов.

9. Контрольные вопросы.

1. Описать последовательность передачи энергии возбуждения при ФДЭ от света к окисленному субстрату. Что произойдет, если:

а) квантовый выход интерконверсии для двух выбранных ФС составляет в одном случае 0,01, в другом – 0,9? Следует ли вообще отказаться от ФС с _ик = 0,01, или его все же можно использовать? Для какой цели?

б) преобладает не химическое, а физическое тушение? Следует ли отсюда, что дозовая кривая вообще выродится в прямую , или нет? Как в лабораторных условиях оценить вклад физического механизма тушения для реальных ФС?

2. Как известно, триплетные уровни могут испытывать расщепление в магнитном поле. Исходя из этой возможности, описать возможность управления ФДЭ с помощью наложения внешнего магнитного поля («магнито-лазерная ФДТ»?)

3. Имеются 2 источника излучения засветки типа ОС-150 (некогерентный источник света с квазисплошным спектром). В одном случае для облучения образца сенсибилизированных клеток используется оптическая система зеркального типа (коллимация пучка с помощью отражения от зеркального покрытия, одинаково отражающего все длины волн, испускаемые источником), в другом – световодный кабель из волокна, обрезающего излучение ИК диапазона (  1,5 мкм). В области максимума поглощения ФС интенсивности облучения одинаковы («активные дозы» совпадают). В каком из рассматриваемых случаев следует ожидать более сильного ФДЭ?

4. Имеется возможность наблюдать ФДЭ в описанной схеме измерений с помощью фотоколориметра на двух длинах волн: желтого диапазона (преобладает поглощение) и красного (преобладает рассеяние). Исходные коэффициенты экстинкции одинаковы. Какую из длин волн следует предпочесть для более отчетливого наблюдения ФДЭ?

5. Имеются 2 типа ФС: эндогенный и экзогенный (первый лучше проникает через мембрану эритроцита). Как по характеру дозовых кривых определить, где какой ФС?

Характеристики

Список файлов книги