Лейкоз крупного рогатого скота

           Leukaemia in cattle, Bovine leukosis (англ.); Leukose bovine (франц.)

Лейкоз КРС - хроническая инфекционная болезнь опухолевой природы, основной при­знак которой - злокачественное разрастание клеток кроветворных органов с нарушением их созревания, в результате чего происходит диффузная инфильтрация органов этими клетка­ми или появляются опухоли. Само определение болезни обязывает выдвинуть проблему борьбы с этой инфекцией на первое место И, действительно, после опубликования серий работ о близком генетическом и АГ-родстве ВБЛ с вирусом Т-клеточного лейкоза человека (HTLV-1 и HTLV-2) диагностика и профилактика лейкоза КРС приобретают особую акту­альность. Лейкозы животных диагностируют почти во всех странах мира. Широко распространены в США, ряде стран Европы, Африке и Австралии

                     ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЯ

Почти на протяжении века ученые многих стран проводили исследования по изучению этиологии этого заболевания и лишь 1969 г вошел в историю как год открытия ВЛКРС. Вирус является этиологическим агентом бычьего лейкоза и получил название "вирус лейкоза крупного рогатого скота" (ВЛКРС), или Bovine Leukemia virus (BLV). Морфология и химический состав. Зрелые вирионы ВЛКРС содержат центральнорасположенный электронно-плотный нуклеоид, диаметр которого, в зависимости от методов фиксации и обработки препарата, варьирует от 40 до 90 нм/ Центральная часть нуклеоида отделена от внешней вирусной оболочки промежуточным слоем. Гексагональное очертание нуклеоида в ультратонких срезах предполагает икосаэдрическую симметрию. Внешняя ви­русная оболочка представлена 2-контурной мембраной, которая лабильна, из-за чего диа­метр вирионов может сильно варьировать - от 73 до 120 им. На поверхности внешней обо­лочки выявляют шипики (пепломеры) с пуговкообразным утолщением на конце, длиной 8-11 нм, которые состоят из субъединиц, образованных двумя гликозилированными вирусны­ми белками gp51 и gp30, отвечающими за типоспецифичность. Вирионы имеют плавучую плотность в растворе сахарозы и CsCI, равную 1,15-1,18 г/мл и 1,17-1,33 г/мл соответствен­но. Химический состав вирионов. протеины 60%, липиды 35, нуклеиновые кислоты 2,2, уг­леводы 0,5%.

В структуре ВЛКРС обнаружено 6 основных белков с мол.м. от 10 до 51 кД. 4 негликозилированных белка составляют сердцевину вириона. Два крупных белка являются гликопротеинами - один из которых (р51) расположен на поверхности вириона, другой (р30) - трансмембранный белок. ВЛКРС обладает выра­женной антигенной активностью и индуцирует синтез ВНА и КСА. Он агглютинирует эрит­роциты мышей. За инфекционность и ГА активность ответственен gp51. Поли- и монАТ против gp51 обладают ВН-активностью, подавляют синцитий образуюшую активность вируса, препятствуют выходу из клеток и вызывают ли­зис инфицированных клеток в присутствии комплемента. Оболочка ВЛ КРС содержит 2 белка gp60 (гликопротеин поверхности вириона) и (межмембранный белок). Геном вируса может существовать в 2-х формах геномной 1-цепочечной РНК или в ви­де ДНК, синтезированной на геномной РНК как на матрице, и интегрированной в хромосо­му клетки-хозяина в виде провируса. Геномная РНК содержится только в зрелых вирионах. В жизненном цикле вируса геномная РНК функционирует лишь 1 раз, когда служит матри­цей для фермента - обратной транскриптазы при биосинтезе комплементарной ДНК. Весь объем процессов, необходимый для полной репликации вируса, выполняет­ся с участием ДНК-провируса.

Устойчивость. Установлено, что ВЛКРС чувствителен к температурным возденет разрушается при повторных замораживаниях и оттаиваниях и при нагревании до 56°С в течение 15 мин. Пастеризация молока (74°С в течение 16с) разрушает его, и он теряет инфекционность для ягнят. Вирус обнаруживается в молоке после хранения в течение 72 ч. при 1°С, при 10 и 14,5°С его не обнаруживают через 48 и 24 ч соответственно. Полная инактивация вируса в молоке или вируссодержащей жидкости установлена при 50°С в течение 70 С, при 70-74 °С в течение 17 с или при 56-63 °С в течение 5-30 мин. В цельном молоке, хранившемся при 1,1-5,5°С, происходит постепенное снижение титров ВЛКРС в течение 72 ч; при 9,9 и 14,4°С вирус не обнаруживался уже через 48 и 24 ч хранения. В сливках, собранных после отстоя цельного молока, при 1,1°С через 24, 48, 72 ч вирус был выделен только в пробах первых 2-х сроков отстоя. В разбавленном молоке (до 37,5 %) инфекционность сохраняется в течение 12 ч. Если при рН 6,5 вирус сохраняется в молоке в течение 72 ч, то при рН 7,1- только 48 ч. Снижение кислотности молозива до рН 4,5 разрушает вирус в течение 2 ч, особенно при высоких исходных титрах, а в нативном молозиве вирус сохранялся в течение 18 дн. при комнатной температуре. Прямой солнечный свет инактивирует ВЛКРС в течение 4 ч, УФ лучи - в течение 30 мин (120 Вт   на расстоянии 1 м ). ВЛКРС полностью теряет активность в р-рах натриевого щелока (0,5° мин, 22°С), этанола (2,0%, 4 ч, 22°С), формальдегида (0,5%, 8 ч, 37°С), фенола (0,5%, 4°С). В жидком азоте лимфоциты, несущие провирусную ДНК, сохраняют инфекционность в течение нескольких лет.  Повторное замораживание и оттаивание разрушает клетки и  устраняет инфекционность.

Антигенная структура. Электрофорез очищенных вирионов ВЛКРС в SDS - ПА и гельфильтрация в присутствии гидрохлорида гуанидина показывают в составе вирионов 4 главных негликозилированных белка и 2 гликозилированных.

Антигенная вариабельность и родство. В АГ отношении ВЛКРС отличается от из­вестных вирусов типа С. Не выявлено с помощью ИФ и иммунодиффузии АГ родства меж­ду главным внутренним белком ВЛКРС р24 и группоспецифическими АГ вирусов лейкозов мышей и кошек, опухолей молочных желез мышей, вирусов бабуинов, Мезон-Пфайзера, шерстистых обезьян ВЛКРС, являясь экзогенным ретровирусом КРС, отличается от извест­ных ретровирусов по АГ свойствам, морфогенезу, способности индуцировать синцитий в монослойных культурах клеток и по свойствам ревертазы. Кроме того, в отличие от боль­шинства других лейкемогенньгх вирусов, он присутствует у инфицированных животных в непродуктивном состоянии.

Локализация вируса, вирусоносительство, персистенция. ВЛКРС обнаруживается в клетках молозива и молока естественно зараженных животных. Из слюны, носовых истече­нии, мочи и спермы инфицированных животных его выделить не удалось. Эксперименталь­но и спонтанно зараженный до или после рождения теленок остается инфицированным всю жизнь, несмотря на постоянное присутствие ВНА, выявляемых в РДП, РСК и других серо­логических реакциях. Отсутствие экспрессии генома ВЛКРС при наличии транскрип­ционных провирусов в опухолевых клетках дало возможность предположить, что причиной опухолевой трансформации клеток ВЛКРС является нарушение структуры клеточного гено­ма. Неспособность AT элиминировать ВЛКРС объясняется тем, что этот вирус обычно присутствует в инфицированных лимфоцитах в непродуктивном состоянии и защищен от действия AT. Размножение его не является необходимым для распространения в популяции животных. Инфицированные лимфоидные клетки могут передавать вирусный геном потом­ству во время размножения клеток. От клетки вирус может передаваться также без продук­ции вирусных частиц с помощью механизма Cellular Kissing (клеточного прикосновения), как описано относительно герпесвирусной системы.

Рекомендуемые материалы

Антигенная активность. Инфицированные ВЛКРС животные вырабатывают AT к не­скольким вирионным АГ. Впервые для выявления АГ этого вируса в цитоплазме продуцирующих вирус лимфоцитов КРС был использован метод непрямой ИФ с использованием сыворотки больного лейкозом КРС. В дальнейшем было показано, что выявляемый этим методом АГ является вирионным компонентом, несущим АГ детерминанты, присутствую­щие в главном внутреннем вирионном белке р24. В сыворотке крови больных лейкозом ко­ров обнаружены КСА, к 4-м вирусным полипептидам: р15, р24, gp30, и gp51. В сыворотке крови телят и ягнят, родившихся от больных лейкозом животных, имеется высокий уровень специфических AT, сохраняющийся в течение 5-6 мес. после рождения у телят и 3 мес. у яг­нят. Наличие высокого титра колостральных AT способно нейтрализовать инфекции ВЛКРС и предотвратить заражение новорожденных телят при условии их содержания раз­дельно от больных коров. AT вырабатываются преимущественно на структурный белок gp51 и относятся к IgC, IgA и IgM. Наличие AT не предотвращает развития опухолей.

Экспериментальная инфекция. Болезнь можно воспроизвести на новорождённых те­лятах и овцах при введении им различных вируссодержащих материалов. Эксперименталь­ному лейкозу предшествует бессимптомная онковирусная инфекция, переходящая в после­дующем в гематологическую стадию болезни с развитием характерной клинической и патоморфологической картины. У заражённых животных гематологическая стадия характеризу­ется постоянным лейкоцитозом и лимфоцитозом. Воспроизведение лейкоза у овец осуществляется с большим постоянством и в более короткие сроки по сравнению с КРС. После внутриперитонеального, подкожного, внутримышечного введений нативных лейкоцитов, краткосрочных культур клеток лейкозной коровы и бесклеточных фильтратов культура ной жидкости этих культур у всех заражённых телят и овец через 15-90 дн., в зависимости от дозы и активности вводимых материалов, развивалась инфекция, выявляемая как серологи­ческими, так и вирусологическими методами. В условиях опыта животных можно заразить аэрозольно и интраназально. Инфекцию ВЛКРС можно также воспроизвести на козах, однако без клинических при­знаков лейкоза. Введение ВЛКРС в организм шимпанзе сопровождалось образованием в длительной циркуляцией вирусспецифических AT, однако выделить инфекционный вирус не удалось. Показана возможность пассирования вируса (шт. FLK) через новорождённых ягнят. В 6-и последовательных пассажах прослежено изменение некоторых биологически свойств вируса: усиление его лейкозогенности и иммуносупрессивного действия, сокраще­ние сроков индукции синтеза вирусспецифических AT после инфицирования. Длительное выявление вирусспецифических AT без клинических проявлений лейкоза наблюдается так­же у заражённых ВЛКРС кроликов и свиней. Инфицирование ВЛКРС мышей, крыс, хомячков, морских свинок, собак, белок, кошек и птиц (цыплят, голубей) не сопровождается развитием лейкозного процесса или выработкой вирусспецифических AT. Изучены свойства ВЛКРС на кроликах, трансгенных по гену антисмысловой РНК (асРНК) ВЛКРС. Иммунный ответ на экспериментальное заражение ВЛКРС, выявляемым в серологических реакциях, наблюдали у одного из 4-х трансгенныхк у 3-х из 4-х контрольных кроликов через 1-3 мес. Реизолировать ВЛКРС удалось от трек контрольных кроликов, тогда как от трансгенных кроликов вирус не выделяли. Kpoлики наиболее чувствительны при заражении их внутривенно нативными лейкоцитам от больной лейкозом коровы. Кролики могут служить лабораторной моде­лью при изучении ВЛКРС. Через 28-35 дней после заражения опытные кролики и овцы продуцировали антивирусные AT, выявляемые в РИД. В клетках нелимфоидного происхождения ни ВЛКРС, ни его АГ не обнаруживаются. С помощью молекулярной гиб­ридизации показано, что в этих клетках отсутствуют последовательности ДНК провируса.

Культивирование. Вирус лейкоза впервые удалось обнаружить в куль­турах лимфоцитов крови инфицированных животных. ВЛКРС репродуцируется в пере­виваемых хронически инфицированных культурах клеток тканей животных разных видов. Наибольшее распространение получила перевиваемая линия клеток FLK-BLV, кото­рую получил в 1974 г. Van der Maaten путём сокультивирования эмбриональных клеток почки овцы с лимфоцитами лейкозной коровы. Эта линия клеток используется для биохи­мических, морфологических и серологических исследований. В настоящее время получены и широко используются перевиваемые хронически инфи­цированные ВЛКРС линии клеток: фибробласты легкого эмбриона коровы (АИД-15), почки эмбриона коровы (ПЭК); почки эмбриона овцы (FLK-BLV); легкого эмбриона летучей мы­ши (T61-Lu); легкого макаки-резус (BLV-Simian); селезенки овцы (FLS, J-1228); тимуса эм­бриона коровы (ТЭК-МВА-766 LmTT).  Способность ВЛКРС индуцировать в монослойных куътурах клеток образование синци­тиев (многоядерных клеток) была использована для разработки специфичного, чувствитель­ного и быстрого диагностического теста для вьывления инфекционного вируса и ВНА. Этот тест обеспечивает количественные результаты и применяется для прямого выявле­ния ВЛКРС - инфекции у  животных.

Особенности репродукции. В краткосрочных культурах вирус накапливается во внеклеточных пространствах, но может формировать и внутриклеточные скопления, заключенные в цитоплазматические вакуоли. Почкующиеся формы вирионов можно обнаружить через 3-9 ч культивирования. В нативных лимфоцитах крови больных животных вирионы ВЛКРС, как правило, обнаружить не удается. Почкование вируса сопровож­дается значительной дистрофией цитоплазмы. Инфицированные ВЛКРС клетки индуци­руют формирование синцития из клеток индикаторных культур. Очаг синцития яв­ляется результатом действия одной биологически активной инфекционной вирусной части­цы и представлен поликариоцитом, образованным в результате слияния 5-25 клеток.

ГА свойства. ВЛКРС агглютинирует только эритроциты мышей. Максимальная ГА на­блюдается при рН 6 и температуре 4°С. После обработки вируса тритоном Х100 или ультра­звуком ГА активность вируса повышается в 6-16 раз. Обработка трипсином, KI04 или нейраминидазой значительно снижает ГА-активность ВЛКРС. Эти данные указывают на то, что ГА ВЛКРС является гликопротеином gp51, который после очистки обладает высокой ГА- J активностью. Обработка мышиных эритроцитов нейраминидазой в 4 раза повышает их способность агглютинироваться.  ГАд свойства не установлены.

                              ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ

Источники и пути передачи инфекции. Источник инфекции - больные лейкозом животные. В естественных условиях инфекция ВЛКРС может передаваться пренатально и постнатально. Механизм пренатальной передачи включает передачу вирусного генома через гаметы (генетическая и хромосомная трансмиссия) и передачу целого вируса (эпигенети­ческая или экстрахромосомная трансмиссия). Постнатальная передача включает передачу вируса через молоко или при контакте. Контактная передача может быть результатом пря­мого воздействия контаминированных вирусом секретов или экскретов или переноса вируса, насекомыми или контаминированными объектами. ВЛКРС может персистировать в лейкоцитах клещей и переноситься ими на здоровых животных. Пренатальная передача ВЛКРС не превышает 20 случаев. Вирус передается от матери плоду трансплацентарно, во время последних 6 мес. внутриутробной жизни, а не через половые клетки. Однако основным путем распространения инфекции в естественных условиях является контактная передача. Так как частицы ВЛКРС не продуцируются in vivo, то логично пред­положить, что в большинстве случаев вирус передается с инфицированными лимфоцитами. Для заражения коровы достаточно ввести внутрикожно 2500 лимфоцитов крови. Учитывая возможность переноса ВЛКРС ничтожным количеством крови, следует иметь в виду, что при не соблюдении элементарных санитарных правил инфекция может распространяться во время выполнения ветеринарных процедур со шприцами, иглами и другими хирургически­ми инструментами, контаминированными кровью. Следовательно, при массовом взятии крови, вакцинации, туберкулинизации и других мероприятиях для каждого животного необ­ходимо использовать отдельный стерильный инструмент. Несоблюдение этого правила рез­ко повышает инфицированность животных неблагополучных хозяйств. Имеются косвенные доказательства того, что распространение инфекции ВЛКРС может осуществляться насеко­мыми. В тропических зонах, например в Венесуэле, где распространены кровососущие насе­комые, пораженность лейкозом особенно высока. ВЛКРС или инфицированные им лимфоциты присутствуют в молоке большинства ин­фицированных животных. Однако, несмотря на то, что молоко и молозиво инфицированных коров содержат вирус, инфекция новорожденным телятам в естественных условиях переда­ется редко по сравнению с контактным заражением. Устойчивость телят, вскормлен­ных инфицированными коровами, к ВЛКРС в течение первых месяцев жизни обусловлена, вероятно, материнскими ВНА, которые приобретают все телята, получающие молозиво. Ес­ли теленок заражен ВЛКРС во внутриутробный период, то колостральные AT не влияют на персистенцию вируса. В зависимости от уровня AT в молозиве, материнские AT исчезают в течение 4-6 мес. после рождения. Внутриутробная передача вируса лейкоза обнаружена у 4 из 50 обследованных новорожденных телят. По мнению авторов, возникновение передачи вируса лейкоза не оказывает существенного влияния на эпизоотологию данной инфекции, чем обосновывают нецелесообразность использования серопозитивных коров в системе противолейкозных мероприятий. В сперме инфицированных быков ВЛКРС не выявлен. Однако, у быков с воспалением генитального тракта могут быть в сперме лимфоциты, инфицированные ВЛКРС. Экспери­ментально установлено, что коров можно инфицировать путем нанесения таких лимфоцитов на слизистую оболочку матки. Таким образом, в случае наличия ВЛКРС в сперме инфици­рованных быков исключена передача вируса от быка корове. Вместе с тем, различий в час­тоте проявления инфекции среди потомства ВЛ КРС положительных и ВЛ КРС отрицатель­ных быков не выявлено. Механизм контактной передачи ВЛКРС не ясен, поскольку не уста­новлено наличие вируса в фекалиях, моче и слюне инфицированных животных. Паренте­ральное введение подопытным животным слюны, выделений из носа, проб выдыхаемого воздуха и мочи инфицированных животных не вызывало депрессии. Исследованиями, про­веденными в динамике опыта, было установлено, что через 60 сут. после прекращения выпаивания молока у 2-х кроликов в сыворотке крови были выявлены антитела к ВЛКРС в РИД, а через 90 сут. еще 5 кроликов были серопозитивными. На морских свинках не удалось установить факт передачи ВЛКРС через молоко. Опытные животные, которым вы­паивали молоко, термически обработанное и контрольные были серонегативными на протя­жении всего срока наблюдения. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что молоко является фактором передачи ВЛКРС. В основном инфекционный процесс у КРС ограничивается 2-мя стадиями: инкубационной и бессимптомного вирусоносительства. Только у небольшого % взрослых животных устанавливают 3-ю и 4-ю стадии: клинико-гематологическое и опухолевое проявление, характерные для лейкоза.

При лейкоза КРС рассматривают 2 пути передачи вируса: неонатальный (внутриутробный) и постнатальный (горизонтальный) Сероэпизоотологические исследования, проведенные на 62 тыс. зараженных ВЛКРС и 47 тыс. здоровых коров, показали, что вертикальный путь не оказывает существенного влияния на эпизоотический процесс. Горизонтальный (контакт­ный) путь является основным в эпизоотическом процессе. В стадах с зараженностью коров-матерей ВЛКРС в пределах 11,3-33,1% широкомасштабными сероэпизоотологическими ис­следованиями 6 – мес. телят (118 тыс. ) в РИД выявляли сравнительно невысокий уровень AT носительства (2,1-4,8%). Одновременно установлено, что в оздоровленных от инфекции ВЛКРС стадах методом постепенной замены зараженных коров серонегативными собствен­ной репродукции первотелками, у последних более 57% матерей положительно реагировали на ВЛКРС.

Симптомы и патологоанатомические изменения. Различают 2 основные формы лейкоза КРС: энзоотическую и спорадическую. Последняя форма встречается редко и поражая молодых животных (до 3-летнего возраста), проявляется клинико-морфологическими разновидностями:  1) ювинальный лейкоз (форма лейкоза у телят) - наиболее часто наблюдается у телят моложе 6-мес возраста, характеризуется увеличением лимфоузлов и часто инфильтрацией костного мозга, 2) тимусная форма лейкоза встречается у телят моложе 2-летнего возраста, характеризуется увеличением тимуса, 3) кожная форма встречается у телят от 1 до 3-летнего возраста, характеризуется узелковой лейкемической инфильтрацией кожи. Спорадический лейкоз не представляет особого интереса. Этио­логический агент при этой форме болезни не выявлен.

Энзоотический лейкоз - контагиозная болезнь с длительным латентным периодом, во время которого в крови выявляют вирус лейкоза КРС (ВЛКРС) и AT к нему. В основном встречается у крупных животных, наиболее часто в возрасте 5-8 лет. Болезнь характеризует­ся пролиферацией неопластических элементов, в результате чего образуются отдельные опухолевые массы и (или) диффузная инфильтрация различных тканей и органов В опухо­левый процесс вовлекаются лимфоузлы, часто поражаются селезёнка, сычуг, сердце, почки и другие органы. Клинические проявления зависят от вовлечённых в патоло­гический процесс органов, степени опухолевого роста и диссеминации неопластического процесса.

Согласно современным данным, энзоотический лейкоз КРС объединяет две группы болезней. Опухолевые болезни первой группы характеризуются инфильтрацией лимфоцитами органов кроветворения с вовлечением в патологический процесс костного мозга (лимфоидный, миелоидный, слабо дифференцированный и недифференцированный лейкозы с раз­личными вариантами). Болезни второй группы (лимфо-, ретикулосаркома, лимфогрануле­матоз) сопровождаются опухолевым ростом, первично проявляющимся в лимфоидной ткани (лимфоузлах, селезенке и других органах). Типично протекающий энзоотический лейкоз в терминальной стадии характеризуется потерей массы, анемией, снижением молочной продуктивности и увеличением одного или нескольких периферических лимфоузлов. Заболева­ние неизменно заканчивается смертью животного через несколько недель или месяцев после проявления клинических признаков.

Патогенез. Патогенез при лейкозе коров изучен недостаточно, АГ вируса обнаружива­ют только в лимфоцитах инфицированных животных после краткосрочного культивирова­ния in vitro. Считают, что лимфоцитоз - результат поликлональной пролиферации В-лимфоцитов, постоянно стимулированных АГ ВЛКРС. Сравнительный анализ резуль­татов изучения интерфероногенеза лейкоцитами крови у здорового, свободного от ВЛКРС, спонтанно инфицированного вирусом лейкоза с картиной крови в пределах физиологиче­ской нормы, а также больного хроническим лимфоидньм лейкозом (ХЛЛ КРС), показал, что титры лейкоцитарного ингерферона в крови спонтанно инфицированных животных снижены в 1,3-2,9, a y больных ХХЛ- в 3,8-9,4 раза по сравнению с клинически здоровыми, свободными от ВЛКРС животными Проведенные исследования показывают, что ВЛКРС обладает иммунодефицитными свойствами, выраженными в данном случае снижением ин­терфероногенеза в лейкоцитах крови.

                                                   ДИАГНОСТИКА

Диагноз на лейкоз ставят на основании эпизоотологических данных, клинических при­знаков, патанатомических изменений и результатов лабораторных исследований, которые включают гематологические и гистологические, а также серологические исследования. Все формы лейкоза характеризуются увеличением в различной степени лимфоузлов. При лимфолейкозе они увеличены равномерно, не сращены с окружающими тканями, кап­сула снимается легко, на разрезе узлы серо-белого цвета, сочные и саловидные. Лимфоузлы при лимфогранулематозе, лимфосаркоме и гистиоцитарной саркоме бугристые, капсула сращена с паренхимой, на разрезе часто обнаруживают кровоизлияния и некрозы, в органах брюшной, тазовой полостей, на серозных оболочках отмечают опухолевые разрастания уз­лов в виде конгломератов серо-белого, желто-серого цвета. Селезенка при лимфоидном, слабодифференцированном и миелоидном лейкозах увеличена. При первых 2-х формах она буро-красного цвета с четко выраженной красной и белой пульпой за счет гиперплазии фол­ликулов. В более поздней стадии болезни граница между белой и красной пульпой стерта. При миелоидном лейкозе селезенка красно-малинового цвета, фолликулы плохо заметны, а в отдельных участках отсутствуют, ткань рыхлой консистенции с кровоизлияниями. При лимфоретикулосаркоме селезенка не увеличена. При всех формах лейкоза отмечают очаго­вые или диффузные разрастания серо-белого или серо-розового цвета в печени, почках, толще сердечной мышцы, органах пищеварения, матке, скелетных мышцах, диафрагме и др органах.

Взятие и подготовка материала. Для гематологического исследования кровь берут из яремной вены в пробирки с антикоагудянтом - 10 %-ном р-ром динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА, трилон В) из расчета 0,02 мл р-ра на 1 мл крови. Не разрешается брать кровь от животных за 15 дней до отела и 15 дней после него. Для сероло­гического исследования кровь берут от животных в возрасте 6 мес. и старше В лабораторию в термосе со льдом направляют 5-6 мл сыворотки Для гисто- исследования ку­сочки пораженных органов (селезенки, лимфоузлов, грудной кости, печени, почек, легких, сердца и правого ушка сердечной мышцы, стенки сычуга, матки и скелетных мышц) посы­лают в свежем виде в термосе со льдом или в 10%-ном р-ре формалина.

Индикация и идентификация вируса

Для определения вируса в различных материалах используют методы, позволяющие выявлять инфекционный вирус или вирусные АГ. Являясь типичным ретровирусом, ВЛКРС находится у инфицированных животных в форме провирусной ДНК, которую можно вы­явить в лимфоцитах крови с помощью ПЦР или методами гибридизации нуклеиновых ки­слот При культивировании инфицированных клеток вирус можно выявить с помощью элек­тронного микроскопа или по образованию синцития в соответствующих индикаторных культурах.

Электронно-микроскопический метод. Позволяет выявлять вирусные частицы в крат­косрочных культурах лейкоцитов крови животных, инфицированных ВЛКРС, и в монослойных культурах клеток, сокультивированных с инфицированными лимфоцитами. По некото­рым данным, лейкоцитарные культуры (лейкоциты крови больных коров) через 48-72 ч представлены разнообразными клетками, среди которых находили лимфоциты и лимфобласты, продуцирующие вирусные частицы типа С. Зрелые вирионы имели ультраструктуру, типичную для онковируса типа С. Вирусные частицы находили, в основном, в межклеточ­ных пространствах и на внешней мембране лимфоидных клеток. Методом ЭМ у больных лейкозом животных обнаруживают в лимфоцитах ядерные "карманы" в виде неправильного кольца и петли. Как правило, они обладают связью с оболочкой ядра и содержат цитоплазматическое вещество клетки. Иногда центральная часть их заполнена электроннолотными гранулами диаметром 4 нм, расположенными группами и напоминающими гранулы гликогена. Ядерные "карманы" отсутствуют в дифференцированных гранулоцитах, моноцитах и плазматических клетках, в одном лимфоците их обнаруживают 1-5 и более.

Тест синцитиеобразования. ТСО применяется для выявления инфекционного вируса в различных материалах и основан на способности ВЛКРС образовывать синцитии в некото­рых нетрансформированных монослойных культурах клеток и в трансформированных пере­виваемых культурах клеток СС81. Метод предложен для титрования ВЛКРС с использова­нием кошачьей линии клеток S⁺L Показано, что инокуляция клеток вирусом лейкемии КРС приводит к образованию крупных многоядерных синцитиев, которые выявляются при ок­рашивании монослоя. Метод можно использовать для титрования вируса, так как имеется прямо пропорциональная зависимость между уменьшением количества синцитиев и разведением вирусной суспензии. Метод является воспроизводимым, специфическим и чувстви­тельным. Рекомендуют микромодификацию метода количественной титрации инфекционно­го ВЛКРС, основанную на определении количества синцитиев в культуре эмбриональных клеток теленка, культивированной с лимфоцитами, зараженньми вирусами лейкемии КРС, или в присутствии вируса. Отмечена линейная зависимость между числом инокулированных в культуре клеток зараженных вирусом лейкоцитов и количеством индуцированных синци­тиев. При сравнении чувствительности макро- и микрометода титрации число синцитиев в микрокультуре статистически не отличалось от числа синцитиев, индуцированных в макро­культуре. Метод сокультивирования используется для выявления инфекционного ВЛКРС Суть его состоит в сокультивировании лимфоцитов крови и чувствительных клеток монослойной культуры с последующим выявлением АГ ВЛКРС с помощью ТСО, РИД или ИФА.

РДП (РИД). Это чувствительный тест для выявления гликолротеина ВЛКРС Позволяет выявлять гликопротеин вируса в концентрации 0,4 мкг/мл.

Биопроба. Инфицированных животных можно выявлять путем постановки биопробы на овцах. С этой целью овцам обычно внутрибрюшинно вводят цельную кровь испытуемого животного. При наличии в пробе крови вируса у овцы развивается инфекция, сопровож­дающаяся образованием вирусспецифических AT. AT у зараженных овец выявляют в РДП с гликопротеинным АГ через 3-6 нед.

Реакция бласттрансформации. Хронический лимфоидный лейкоз КРС характеризует­ся слабой реакцией бласттрансформации (РБТЛ). Поэтому у животных, подозрительных по заболеванию лейкозом по показателям лейкоцитов крови, проводят РБТЛ в культуре лим­фоцитов крови Показатель РБТЛ выражает процент трансформировавшихся лимфоцитов (переходные клетки, бласты, митозы) и определяется после подсчета не менее 1000 клеток культуры У клинически здоровых и с нормальной гемограммой коров, по данным боль­шинства исследователей, он составляет в среднем 60% (40-90%), у больных лимфолейкозом РБТЛ значительно снижена уже в субклинической стадии При повышенном содержании в крови общего количества лейкоцитов исследуют животных в РБТЛ Диагноз на лимфолей-коз считают подтвержденным при показателе РБТЛ не выше 35%. Если он выше, то поста­новку реакции повторяют с интервалом 3 мес. у тех животных, у которых нарастают гемато­логические изменения.

Гистологические исследования. Срезы готовят и окрашивают гематоксилин-эозином. При лимфоидном лейкозе наблюдают в селезенке и лимфоузлах стирание рисунка за счет диффузной инфильтрации клеток лимфоидного ряда, среди которых, в основном выявляют зрелые лимфоциты, в меньшем количе­стве обнаруживают пролимфоциты, лимфобласты. В костном мозге строма сохранена, вы­является значительное истончение и рассасывание балок, скопления лимфоцитов могут рас­полагаться в виде очагов или диффузно, заполняя все костно-мозговые пространства (лимфоидная метаплазия), в почках, печени, сердце, сычуге и других органах обычно выявляют скопления лимфоцитов в просветах капилляров и инфильтрации лимфоидными клет­ками интерстициальной ткани. При недифференцированном и слабо дифференцированном лейкозе (гемо-цитоблазтоз) в костном мозге, селезенке, лимфоузлах и других органах наблюдают очаговые и диффуз­ные пролифераты, клеточный состав которых представлен недифференцированными или слабо дифференцированными клетками типа гемоцитобластов (родоначальная клетка).

Гематологический метод. Основан на обнаружении в периферической крови повы­шенного количества лейкоцитов, в основном лимфоидного ряда, и слабодифференцирован­ных клеток (родоначальных, пролимфоцитов, лимфобластов). Количество лейкоцитов под­считывают с помощью электронного счетчика частиц или в камере Горяева и выводят лей­коцитарную формулу. Животных, подозрительных по заболеванию лейкозом, подвергают дополнительньм гематологическим исследованиям с интервалом 2-3 мес. до получения 2-х подряд качественно одинаковых результатов, по которым их признают здоровыми или больными лейкозом. Следует иметь в виду, что некоторые острые и хронические болезни КРС (перикардиты, ретикулиты, гепатохолангиты, циррроз печени, туберкулез, бруцеллез и др. ) могут сопрово­ждаться лейкоцитозом. При этом в отличие от лейкоза увеличение количества лейкоцитов крови происходит, в основоном, за счет найтрофилов, эозинофилов или моноцитов.

 Число лейкоцитов в 1 мм³ крови здорового, подозрительного и больного лейкозом КРС

 Эти изменения крови имеют временный характер, их дифференцируют от лейкоза повторными гематологи-м исследованиями. Есть методика выделения мононуклеарных клеток из периферической крови инфицированного КРС и их культивирования репродукции инфекционного вируса лейкоза. Метод позволяет получать максимальный с инфицированных вирусом лейкоза лимфоцитов. Из 10 мл цельной крови получают примерно 107 мононуклеарных клеток. Чтобы максимизировать продукцию вирионов и вирус) АГ, к культуре лимфоцитов добавляют Кон-А в конечной концентрации 5 мг/мл.

Конкурентный радиоиммуноанализ (РИА). Наиболее чувствительный метод выявления р24-АГ в краткосрочных культурах лимфоцитов крови инфицированных животных. Метод заключается в том, что экстракт, приготовленный из 48-ч культуры лимфоцитов крови, исследуется на присутствие АГ р24 путем определения его способности предотвращать связывание меченого изотопом р24 со специфическими AT. Для диагностики инфекции ВЛКРС у телят младше 6-мес. возраста, которым выпаивали молозиво инфицированных  матерей, а также у взрослых животных, иммунизированных убитым вирусом или вирусными АГ, необходимо использовать методы, основанные на прямом выявлении инфекционного вируса или вирусных АГ в культурах лимфоцитов крови исследуемых животных.

ПЦР. Дает возможность обнаруживать провирусную ДНК через 2 нед после заражения животных. Для амплификации в ПЦР использовали пары праймеров, соответствующих определенным участкам генов gog 24, env-gp5 или pol вируса лейкоза Метод позволяет идентифицировать одну копию генома вируса лейкоза на 100000 клеток крови. Сконцентрированные также праймеры для амплификации специфических для вируса лейкоза КРС последовательностей генов pol и рХ. С помощью этого набора праймеров удавалось амплифицировать и выявлять 10 копий ДНК вируса в присутствии в образце 1 мкг хромосомной ДНК. Доказана возможность использования нерадиоактивных зондов для выявления вируса лейкоза КРС в лимфоцитах периферической крови и клетках лимфосаркомы. Разработан метод ПЦР с последующей нерадиоактивной блот-гибридизацией для тестирования провируса лейкоза КРС в исследуе­мом материале.

Серологическая идентификация

ИФ. Используют прямой и непрямой варианты при исследовании мазков крови и изме­ненных органов, краткосрочных и перевиваемых культур крови и тканей. Непрямой вариант испытывали на концентрате с 80% живых лейкоцитов. В качестве AT применяли сыворотку больной лейкозом коровы и меченную ФИТЦ кроличью сыворотку против глобулинов быка. При микроскопии препаратов отмечена флюоресценция на поверхности лимфоцитов в виде яркого светящегося кольца или кольца из пунктиров. В препаратах из лейкоцитов здоровых животных подобного свечения не наблюдается или оно слабо выражено в некоторых клет­ках Для объективной оценки препаратов рассчитывается индекс флюоресценции (ИФ) по формуле ИФ = (А - В) : А, где А - процент несветящихся клеток в контроле; В - процент не­светящихся клеток в опыте. Положительной считается реакция, если ИФ свыше 0,2 ; сомни­тельной - 0,11-0,2; отрицательной - ниже 0,1.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика. У животных, зараженных ВЛ КРС, вырабатываются AT к вирусным АГ, которые выявляются с помощью серологических реакции. Характерной особенностью инфекции ВЛКРС у КРС является, как правило, по­жизненная персистенция вируса и вирусспецифических AT у больного животного. Поэтому серологические методы обнаружения специфических сывороточных AT являются наиболее практичными, экономичными и широко используемыми в диагностике онковирусной ин­фекции у КРС. Серологическими методами ВЛКРС можно выявлять у животных старше 6 нес, так как у телят, выпаиваемых молозивом и молоком инфицированных ВЛКРС матерей, появляются пассивно приобретенные материнские AT, которые могут персистировать до 6-мес. возраста. У зараженных животных в крови циркулируют AT к нескольким структурньм белкам вируса. Однако диагностическое значение имеют AT против gp51 и р24 ВБЛ. Количественные соотношения AT анти-р24 и анти-gр51 могут коррелировать со стадией инфекционного процесса, но при этом, AT к gp51 появляются раньше и содержатся в более высоком титре, чем антитела к р24 и, следовательно, серологические реакции, на­правленные на выявление aimi-gp51 - AT по со чувствительности будут превосходить аналоги, в которых используется в качестве АГ р24.

В научно-исследовательских лабораториях для обнаружения специфических AT исполь­зуются РН, подавления раннего и позднего поликариоцитоза, нейтрализации псевдотипов и радиоиммуноанализ (РИА). Для эпизоотологического обследования, контроля и борьбы с ВБЛ-инфекцией широко применяют РИД и ИФА, для постановки кото­рых выпускаются соответствующие коммерческие диагностические наборы. Все вышепере­численные методы предназначены для выявления AT в индивидуальных пробах сыворотки. Для обнаружения AT в низких титрах, например, в индивидуальных пробах молока или в сывороточных пулах, иди в образцах, полученных из молочного танка, требуется высокая чувствительность РИА или ИФА. Разработан ряд серологических реакций для диагностики инфекции, таких как РИФ, РСК, РДП в геле, реакция агглютинации латекса (РАЛ), ELISA, РНГА и реакция нейтрализации псевдотипа (РНПТ).

РДП. Благодаря простоте, специфичности и достаточно высокой эффективности эта ре­акция получила наибольшее применение с гликопротеинным АГ ВЛКРС. Из вируса, осаж­денного методом ультрацентрифугирования культуральной жидкости краткосрочных культур лейкоцитов лейкозных животных, очищенного в градиенте плотности сахарозы и обра­ботанного эфиром, получают АГ, который используют в РДП. С помощью этого АГ в сыво­ротках крови инфицированных ВЛКРС животных выявляют ПА к внутреннему полипептиду вируса р24. РДП с гликопротеидным AT - более чувствительный метод выявления инфици­рованных ВЛКРС животных, чем РДП с полипептидным АГ РДП (РИД) в геле агара, на­правленная на выявление анти-gр51 AT, используется в качестве основного диагностическо­го теста, регламентирующего международную и внутреннюю торговлю племенными живот­ными, спермой и эмбрионами. При первичном обследовании сывороток крови одной РИД считается достаточно для объявления стада свободным от ВБЛ-инфекции. РИД приме­няется в системе противолейкозных мероприятий в неблагополучных хозяйствах.

Специфические ПА к ВЛКРС появляются через 2 мес. после инфицирования и сохраня­ются пожизненно. Для постановки РДП используют диагностический набор, в состав кото­рого обязательно должны входить специфический АГ ВЛКРС, специфическая положитель­ная сыворотка крови КРС Реакцию ставят макро- и микрометодами. Для изготовления АГ используют клеточную линию FLK-BLV. Из культуральной жидкости вирусный АГ выде­ляют методом преципитации сульфатом аммония или полиэтиленгликолем. Но наиболее технологичным методом выделения вирусного АГ считают ультрафильтрацию на полупро­ницаемых мембранах. На результат реакции иммунодиффузии влияют многие факторы ка­чество АГ и контрольных сывороток, количественные соотношения АГ и AT, качество агаpa, pH и ионная сила буфера, температура, диаметр лунок и расстояние между ними. Для постановки РИД выпускают диагностические наборы. Они представляют собой наборы, состоящие из 2-8 препара­тов. Обязательными компонентами каждого набора являются препараты тест-системы: ви­русный АГ и антисыворотка, которые в результате специфического взаимодействия АГ (gp51 ВБЛ) и AT в процессе диффузии формируют в геле агара нерастворимый комплекс в виде опалесцирующей полосы. Дополнительно наборы могут комплектоваться сухой соле­вой смесью агара, стерильным разбавителем для вирусного АГ и контрольньми сыворотка­ми, которые поставляются в жидком или лиофилизированном виде. В последнем случае на­боры комплектуют соответствующими разбавителями контрольных сывороток. Наборы рас­считаны на 90-500 исследований и содержат 3-5 мл вирусного АГ.

РИД проходит в 0,8-1,0% геле агара, который готовят на трис-НС! или боратном буфе­рах в диапазоне pH 7,2-8,6, содержащим 8-8,5% NaCl. Методика постановки реакции оди­наковая для всех диагностикумов и предусматривает заполнение лунок АГ, антисывороткой и испытуемыми сыворотками по схеме 1:2:4 или 1:3:3. Принято 2 стандарта на диаметр лу­нок и расстояние между ними: 1 вариант в странах ЕЭС, тогда как в США, Канаде и стра­нах СНГ приняты параметры, соответствующие второму варианту.

                              Параметры лунок, рекомендуемые для постановки РИД

     Минимальные необходимые требования, которым должен удовлетворять диагностиче­ский набор, заключаются в следующем: АГ должен содержать оболочечный гликопротеин ВБЛ, стандартизованный по референтной сыворотке -1; референтная сыворотка Е-4, раз­веденная отрицательной сывороткой в соотношении 1:10, должна быть выявлена как поло­жительная без повторной постановки реакции или предварительной концентрации. Референтные сыворотки Е-1 и Е-4 изготовлены в Национальной ветеринарной лаборатории Да­нии (P.O. Box 373, DK-1503 Copengagen) и предназначены для стандартизации всех диагно­стических наборов для постановки РИД и ИФА. Реакцию учитывают через 48 ч и при следующих показаниях контролей: наличие четкой контрольной полосы преципитации между АГ и специфической положительной сывороткой и отсутствие таковой с отрицательной контрольной сывороткой. Животных, сыворотки которых положительно прореагировали в РДП, считают зараженными ВЛКРС.

Описаны модификация метода иммунодиффузии - усиленная танином непрямая двойная иммунодифузия в геле (НИД-Р) и её применение для выявления AT и АГ ВЛКРС. Со­временная диагностика энзоотического лейкоза КРС основана большей частью на тестах иммунодифузии и ELISA. При использовании РИД необходимо придерживаться рекоменда­ций производителя очень дорогого АГ. В целях снижения затрат при сохранении надежно­сти результатов исследователи уменьшили размер отверстий в розетке и слой агара в чашке Петри, сохраняя прежнюю чувствительность теста.

Предложен метод очистки вируса лейкоза КРС в градиенте плотности перколла. Метод рекомендован для получения очищенного вируса и специфического АГ. Показано значительное преимущество РИД при исследовании молозива титр AT был в 8-32 раза выше, чем в пробах сыворотки крови, исследовать необходи­мо первые порции молозива.  Титр AT к gp51 и р24 ВЛ КРС сразу после отела был наивысшим – 1:2187- 1:59049 в ИФА и 116-1 512 в РДП. Через 1 сут. титр AT составлял 25% от исходного.

РАЛ. В качестве теста для прижизненной диагностики лейкоза КРС можно использо­вать иммунохимическую реакцию агглютинации с латексом в соответствии с временными методическими рекомендациями Животные, сыворотки крови которых дали положитель­ную реакцию агглютинации с латексом, подлежат тщательному обследованию на лейкоз другими методами. Реакция перспективна для прижизненной диагностики лейкозов Испытание показало в 67% случаев совпадение результатов с гематологиче­скими и около 90% с гистологическими методами диагностики гемобластозов КРС.

ИФ. Менее широко применяют для обнаружения AT в сыворотках крови инфицирован­ных животных. При этом используют в качестве клеток-мишеней перевиваемые культуры, хронически инфицированные ВЛКРС.

Рекомендация для Вас - Особенности размещения территориальной организации отраслей промышленности.

РНГА. Является чувствительным методом обнаружения AT в сыворотке крови и моло­ке Рекомендуют использовать при экспертизе и санитарной оценке молока Наибольший процент совпадений гематологических показателей с результатами серологических исследо­ваний был отмечен в РНГА.

ELISA. Широко применяют в США, Бельгии с использованием монАТ для широко­масштабного выявления энзоотического лейкоза в стадах КРС. Чувствительность его выше чем РДП. Метод ELISA при диагностике лейкоза КРС может существенно повысить чувст­вительность серодиагностики по сравнению с РДП Он удобен для систематического кон­троля молока коров благополучных хозяйств. Существующие варианты ИФА включают 5 принципиальных этапов постановки реакции.

Аллергическая реакция. Разработан аллерген для диагностики лейкоза у животных. Для проведения аллергических реакций наиболее подходящее место хвостовая складка у овец и КРС и дорсальная поверхность уха у свиней.

Дифференциальный диагноз. Лейкоз необходимо отличать от актиномикоза, туберку­леза, паратуберкулеза и бруцеллеза. При актиномикозе поражаются, главным образом, лимфоузлы головы и грудной области (подчелюстные, заглоточные, околоушные и др.). Они плотной консистенции, с инкапсулированными абсцессами. В центре актиномикозного ума (гранулемы) гистологически обнаруживают друзы гриба. При туберкулезе чаще пораженш в виде узелков, имеющих специфическое гистологическое строение, находятся в легких, кишечнике. Для паратуберкулеза характерно наличие изменений в кишечнике и брыжееч­ных лимфоузлах. В кишечнике развиваются продуктивное воспаление и очаговые инфильт­раты из эпителиоидных клеток, в результате чего стенка утолщается в 5 и более раз. В лимфоузлах отмечают обширные скопления из эпителиоидных элементов с наличием среди им гистиоцитов и клеток типа Лангерганса. Специфическим методом окраски выявляют бакте­рии паратуберкулеза, локализующиеся в эпителиоидных и гигантских клетках. Бруцеллез диагностируют с помощью РСК, РА .

                    ИММУНИТЕТ И СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ПРОФИЛАКТИКА

Проблема специфической профилактики лейкоза КРС не решена, хотя исследования в этой области продолжаются и по сегодняшний день. Против лейкоза КРС получена рекомбинантная вирусвакцина, содержащая генетическую информацию, кодирующую gp51 и gp30 поверхностного АГ. Также показана возможность вакцинации КРС против лейко­за гетерологичными клетками млекопитающих, способными продуцировать оболочечные АГ ВЛКРС и его внутренний белок р24. Опубликованы результаты исследований по получению и использованию рекомбинантных вирусов осповакцины, включающих либо полный ген белка оболочки (env), либо толь­ко фрагмент гена env с последовательностью, кодирующей гликопротеин gp51 env и часть gp30 ВЛКРС. Вакцинация овец рекомбинантными BLV-вакцинами, содержащими полный ген env, защищает овец от инфекции ВЛКРС, свидетельством чего служит отсутствие персистенции высоких титров анти-gp51-AT по сравнению с невакцинированными ВЛ инфициро­ванными животными, ярковыраженная пролиферативная реакция клеток СД-4 вакциниро­ванных овец на специфические синтетические пептиды gp51 ВЛКРС и отсутствие провируса ВЛКРС у вакцинированных животных спустя 4 мес. после заражения диким вирусом.

ВЕТЕРИНАРНО – САНТИТАРНАЯ ОЦЕНКА ПРОДУКЦИИ. При поражении мышц, л/у туши, паренхиматозных органов или  при выявлении лейкозных разрастаний на серозных покровах туши её независимо от упитанности и продукты убоя утилизируют. При отсутствии паталогиеских изменений направляют  образцы на бактериологическое исследование на сальмонеллёз. В случае обнаружения сальмонелл  внутренние органы утилизируют, а тушу направляют на проварку. При отсутствие сальмонелл  разрешается перерабатывать на  варёные, варёно –копчёные колбасы , консервы или проварку.