Инфекционный   ринотрахеит      к р с

Exanthema coitale vesiculosum bovis (лат.); Infectious bovine rhinotracheitis(англ.);                     Infectiose bovine Rhinotracheitis/Infectiose pustulose Vulvovaginitis des Rindes,

Blaschenausschlag, Koitalexanthem (нем.)

Инфекционный ринотрахеит (ИРТ, пузырьковая сыпь, инфекционный вульвовагинит, инфекционный некротический ринотрахеит, инфекционный ринит, «красный нос», контагиозная бронхопневмония, инфекционный катар верхних дыхательных путей) - остропрокающая контагиозная болезнь КРС, характеризующаяся преимущественно катаральнонекротическими поражениями дыхательного тракта, лихорадкой, общим угнетением и| конъюнктивитом, а также развитием пустулезного вульвовагинита, при попадании вируса в половые органы животного и абортами. Болезнь распространена повсеместно. В СССР впервые диагностирована в 1969 г

ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЯ

Вирус ИРТ впервые выделили  Медин, Йорк и Мак-Керчер в 1956 г., Ли и Бейкер - в 1957г

Устойчивость. При -60-70°С вирус выживает 7-9 мес, при 56°С инактивируется через 20 мин, при 37°С - через 4-10 сут, при 22°С- через 50 сут. При 4°С активность вируса сни­жается через 30-40 сут всего лишь на 1 lg. Лиофилизация почти не влияет на его активность, однако замораживание и оттаивание снижают вирулентность и иммуногенность вируса. Р-ры формалина 1:500 инактивируют вирус через 24 ч, 1:4000 - через 46, 1:5000 - через 96 ч. Ацетон, эфир, хлороформ и этиловый спирт инактивируют его немедленно. Предпола­гают, что под воздействием эфира деградирует наружная липосодержащая мембрана вириона или экстрагируется вирусная нуклеиновая кислота. В кислой среде вирус быстро теряет активность, длительно (до 9 мес) сохраняется при рН 6-9 и в условиях 4°С. Имеются сооб­щения о выживании вируса в сперме быков, хранящейся при температуре сухого льда, в те­чение 4-12 мес, а в жидком азоте - в течение года. Возможна инактивации вируса в свежей сперме быков при обработке её 0,3%-ным р-ром трипсина.

АГ структура. В деталях не изучена. Выделено и охарактеризовано 9 структурных бел­ков вируса ИРГ: VP105, VP90 (гемагглютинин), VP74, VP64, VP54, VP50, VP47, VP40, VP31. Гликопротеины gl, gill, glY участвуют в формировании гуморального и клеточного иммунитета. Наиболее эффективным- в этом отношении является gIV. По данным РН наибольшей иммуногенностью обладают VP74 и VP90. Главные нейтрализующие эпитопы расположены на ГА-домене, что сви­детельствует о перспективности использования ГА-антигена для приготовления субъеди­ничной вакцины.

АГ вариабельность и родство. В настоящее время известно 5 типов герпесвируса КРС: герпесвирус-1 - возбудитель ИРТ; герпесвирус-2 - возбудитель герпетического маммиллита, генерализованного поражения кожи, стоматита; герпесвирус-3 - является причиной злокаче­ственной катаральной лихорадки; герпесвирус-4 - обнаруживается у здоровых животных, а также у особей с субфибрильной температурой и гнойным дерматитом, при послеродовом мастите и респираторной инфекции.        Установлено, что вирусы, выделенные при респираторном (ринотрахеит - 1-й тип) и генитальном (пустулезный вульвовагинит - 2-й тип) синдромах, в АГ отношении идентичны, однако имеют различную электрофоретическую подвижность. Показано АГ отличие новозе­ландских шт. от американских и австралийских шт. В АГ отношении вирус ИРТ отличается от вирусов простого герпеса, бычьих герпесвирусов, но проявляет некоторое родство с вирусом РПЛ в РСК и РДП. По данным Deptula W.et.al., существует 3 типа вируса ИРТ КРС: 1, 2 (подтипы 2а, 2Ь) и 3 (подтипы За и ЗЬ). Ус­тановлено существование АГ вариантов герпесвируса 1 КРС, выявляемых в следующих ре­акциях: 1) перекрестной РН с сыворотками кролика; 2) гель-электрофорезе меченных ра­диоизотопами вирусиндуцированных полипептидов и гликопротеинов; 3) взаимодействия с наборами моноклон. AT, что выявляется реакцией непрямой ИФ, а также при анализе вирусной ДНК с помощью рестрикционной эндонуклеазы.

В Танзании AT к вирусу ИРТ КРС обнаруживались животных у других видов: у 76% взрослых буйволов, у 33% телят буйволов, у 24% свиней-бородавочников. Лабораторные животные к экспериментальному заражению вирусом ИРГ невосприимчивы.

Локализация вируса. Вирус ИРТ обладает тропизмом к клеткам органов дыхания и размножения. У телят при ИРТ его находят в носовых истечениях уже через день после по­явления первых признаков болезни и выделяют в течение 14 дн. Наибольшая концентрация его в носовой слизи и содержимом конъюнктивального мешка бывает на 5-6-й дн после за­ражения. Вирус можно выделить также из слизи, взятой из трахеи, носовой перегородки, крови, слюны и мочи больного животного. Видимо, существует тро­пизм вируса ИРТ и к клеткам пищеварительного тракта. В наибольших титрах он обнару­жен в прямой кишке больных телят. Вирус ИРТ может мигрировать со слизистых оболочек в ЦНС через аксоны нервных клеток внутри нервных волокон. ЦНС поражается вследствие центростремительного рас­пространения вируса через тройничный нерв и его гассеров узел, а менингомиелит возника­ет при проникновении вируса по нервным окончаниям, ганглиям и корешкам в спинной мозг. Вирус внедряется в нейроны спинномозговых ганглиев и сохраняется там в период ла­тентной инфекции. Латенция вируса ИРГ порождает ряд проблем, создающих большие трудности в борьбе с этой болезнью. Оказалось, что после заражения КРС вирулентным штаммом все животные становятся латентными носителями вируса точно так же, как и все вакцинные (аттенуированные) штаммы вируса остаются в организме в латентном состоя­нии. Диссеминация аттенуированных шт. в окружающую среду практически не контролиру­ется. Вакцинация не предотвращает в организме вакцинированных животных латенции ви­рулентного вируса. Иммунный статус латентно инфицированных животных влияет на ха­рактер выделения вируса. Не выяснено, происходит ли рекомбинация аттенуированного и полевого вирусов в организме латентно инфицированного обоими шт. животного.

Рекомендуемые материалы

Относительно сроков вирусоносительства серонегативными животными-реконвалесцентами данные противоречивы. У некоторых они продолжались 6-12 и даже 19 мес. Эпизоотологическая роль латентного вирусоносительства при ИРТ не изучена. Описано выделение вируса герпеса из культур клеток селезенки плода КРС после длительного культивиро­вания его m vitro (30-67 дн). Вирус ИРТ выделен из тканевых эксплантатов тройничного нерва клинически здоровых коров. Переболевшие животные могут быть серонегативными, но выделять вирус со спермой. Доказано постоянное выделение вируса от ла­тентно инфицированных телят после введения им синтетических кортикостероидов. В этом случае вирус выделялся из тканей верхних дыхательных путей и реже - из культур клеток других органов От животных, не получавших кортикостероиды, вирус выделить не удава­лось. Показано, что кортикостероиды могут реактивировать персистирующий вирус даже через 5 лет после первичного заражения. У таких животных уровень AT, как правило, остается прежним или же несколько увеличивается; клинически такая провокация сопрово­ждается поражением эпителия респираторного тракта и слизистой оболочки носоглотки.

При обследовании быков-производителей в 1992-1994 гг. в племхозяйствах Сибири с использованием гибридизационной тест-системы, содержащей нерадиоактивный (биотини лированный) ДНК-зонд, показана высокая степень латентной инфекции и эффективность тест-системы для её выявления. Высказано предположение, что сенсорные ганглии являются местом латентной персистенции вируса и что реактивация его в иммуносупрессированном организме может привести к распространению вируса от ганглиев через нервные клет­ки к слизистым оболочкам, при этом он оказывается недоступным воздействию гумораль­ных AT. У животных, привитых живой вакциной после провокации кортикостероидом, так­же могут появиться клинические признаки болезни Вирус у быков-производителей может выделяться после переболевания до 6 мес, и они могут заражать коров при случке. Вирусо-носительство не связано с присутствием AT, однако с появлением их вирус из влагалищных выделений выделить не удавалось.

Влияние вируса на плод. Плод КРС очень чувствителен к вирусу ИРТ. Заражение его возможно как во второй половине утробного развития, так и в конце первого периода эм­бриогенеза. Виремия в постнатальном периоде наблюдается в течение короткого времени и бывает слабо выражена. Аборты у животных, заболевших во время беременности, как пра­вило, являются следствием гибели плода. Самый высокий титр вируса обнаруживают в ко­тиледонах, даже когда в самом плоде вируса уже нет. В плаценте также обычно содержится много вируса, даже когда нет ее видимых поражений. Изолировать вирус из плаценты впер­вые удается через 8 дн после заражения беременного животного. Аборт может наступить не ранее чем через 3 мес после прививки живой вакциной.

АГ активность. Гликопротеины являются основными АГ вируса ИРТ, связанными с нейтрализацией вируса. При раздельной иммунизации телят очищенными гликопротеинами вируса ИРТ - gl и gIV максимально иммуногенными оказался гликопротеин gIV, а также безвирусный лизат инфицированных клеток. Предполагается, что гликопептид мол.м. 71,5 кД является АГ, ин­дуцирующим синтез AT, участвующих в цитотоксичности, а полипептид VP8 (мол.м. 73 кД) индуцирует синтез ВНА.

При естественном и экспериментальном заражениях вирус индуцирует образование ВНА, КСА и ПА. В сыворотке крови переболевших или иммунных животных присутствуют AT, которые выявляются РИГА. Нет корреляции между титром AT и сроками выделения вируса от больных животных. Показано, что 19S - раннем 7S - поздние AT быстрее нейтра­лизуют гомологичные, чем гетерологичные штаммы. ВНА могут быть комплементзависимые и комплементнезависимые. В ответ на первичную естественную инфекцию происходит накопление первых AT, титр их быстро снижается и через 6 мес приближается к титру комплементнезависимых AT. Эти различия можно использовать в ретроспективной диагностике для суждения о давности переболевания животного.В индукции сывороточньгх ВНА при ИРТ участвуют 4 гликопротеина. Установлен переход специфических молозивных AT против ИРТ у новорожденных телят в секреты дыхательных путей уже в 1 дн после потребления молозива. Титры AT в секретах носовой полости в большинстве случаев не превышали 1:8 (в молозиве, сыворотке матерей и сыворотке телят они достигали 1:128 - 1:256) и их устанавливали лишь к 15-20дн.

Культивирование. Вирус ИРТ культивируется в монослое клеток почки телят, в эмбрионах коров. При низких титрах вируса его ЦПД в культуре клеток наступает че­рез 48-96 ч. Это действие нейтрализуется специфической сывороткой. Для культиви­рования пригодны перевиваемые линии клеток почек и тестикулов телят. Изменения в них развиваются на 4-6-е сут. Репродукция вируса сопровождается подавлением митотической активности клеток и образованием внутриядерных включений. Появляется большое число включений, которые, сливаясь между собой, образуют одно крупное включе­ние с выраженным светлым ободком. Оно занимает почти все пространство ядра. Хроматин сохраняется в виде узкого ободка, непосредственно прилегающего к ядерной оболочке, це­лостность которой, как правило, не нарушается. Выявляются симпласты. Клетки пикнотизируются, округляются и отторгаются от стекла. Вирус, выращенный в монослое клеток МДВК, обладает стабильной активностью. Помимо первичных и перевиваемых культур клеток используют органные культуры слизистых оболочек верхних дыхательных путей, ротовой полости, ЖКТ, конъюнктивы, влагалища телят и эмбрионы коров. В культу­рах из органов вирус обнаруживали через 29 дн после заражения. ЦПД развивалось фокусно, сначала по периферии эксплантатов. В органных культурах слизистой оболочки носа и трахеи телят, убитых на 2-й и 7-й дн после заражения, вирус находили в течение 1-2 мес. В культуре клеток под агаровым покрытием на 4-6-й дн инкубации вирус ИРТ образует округ­лые, с ровными краями бляшки, диаметром 1-2 мм.

ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ

Источники и пути передачи инфекции. Источник инфекции - больные животные и латентные вирусоносители. Особенно опасны быки-производители. Восприимчивые живот­ные обычно заболевают через 10-15 сут после поступления в неблагополучное хозяйство. Установлена возможность контактного, интраназального, воздушно-капельного заражения животных, а также через инфицированные корма, транспортные средства, работников жи­вотноводства, птиц, насекомых и т.д. Особенно опасна абортивная форма болезни, так как она трудно выявляется и может быть причиной эпизоотии. В  Африк антилопа гну является латентным носителем ви­руса ИРГ. Помимо того, вирус может реплицироваться в клещах, которые играют роль в возникновении заболевания среди КРС.

Клинические признаки. У КРС болезнь проявляется 5-ю формами: поражением верхних дыхательных путей, вагинитами, энцефалитами, конъюнктивитами и артритами. Кроме того, у телят возможна пневмония. При хронической серозно-гнойной пневмонии поги до 20% телят. В зависимости от способа передачи возбудителя болезнь может проявляться преимущественным поражением верхних дыхательных путей или половых органов, абортами, энцефалитами и у телят кератоконъюнктивитами. При генитальной форме пор наружные половые органы, иногда у коров развивается эндометрит, а у быков - орхит, что может стать причиной бесплодия. У быков, используемых для искуственного осемен ИРТ проявляется рецивирующим дерматитом (облысением, образованием струпьев) промежности, вокруг ануса, иногда на хвосте, ягодичной области и мошонке. Инфицированная вирусом сперма может быть причиной эндометритов и бесплодия коров.

Аборты и гибель плода в утробе матери отмечались через 3 нед после заражения, что совпадает с повышением титра специфических AT в крови матери. Присутствие AT в высоком титре у стельных коров-реконвалесцентов не предупреждает аборты и смерть плода в утробе матери. Возможно, с этим свойством вируса связаны его длительная персистенция в тканях и склонность ИРТ к латентному течению при генитальной форме в эпителии слизи­стой влагалища, его преддверии и вульве образуются многочисленные разной величины пустулы (пустулезный вульвовагинит). На их месте появляются эрозии и язвочки. После за­живления язвенных поражений на слизистой оболочке длительное время остаются гипере-мированные узелки. У больных быков процесс локализуется на препуции и поло­вом члене. Характерным является образование пустул и пузырьков. У незначительной части стельных коров наблюдают аборты, рассасывание плода или преждевременный отел. Абор­тировавшие животные, как правило, ранее переболевали ринотрахеитом или конъюнктиви­том. Нередко аборты бывают после прививки живой вакциной против ИРТ. Среди аборти­ровавших коров возможны летальные исходы из-за метритов и разложения плода. Однако, нередки случаи абортов при полном отсутствии воспалительных процессов на слизистой оболочке матки коровы. При ИРТ встречаются случаи острого мастита. Вымя резко воспа­лено и увеличено, при пальпации становится болезненным. Сильно снижаются надои.

При менингоэнцефалитах наряду с угнетением отмечают расстройство двигательных функций и нарушение равновесия. Болезнь сопровождается мышечным тремором, мычани­ем, скрежетом зубов, конвульсиями, слюнотечением. Такой формой болезни, в основном, заболевают телята 2-6-мес возраста.

Респираторная форма инфекции характеризуется внезапным повышением температуры тела до 41-42°С, гиперемией слизистой оболочки носа, носоглотки и трахеи, угнетением, су­хим болезненным кашлем, обильным серозно-слизистым истечением из носа (ринитом) и пенистым слюноотделением. По мере развития болезни слизь становится густой, в дыха­тельных путях образуются слизистые пробки и очаги некроза. При тяжелом течении болезни отмечают признаки асфиксии. Гиперемия распространяется на носовое зеркальце («красный нос»). Доказана этиологическая роль вируса ИРТ при массовом кератоконъюнктивите мо­лодняка КРС. У молодняка болезнь проявляется иногда в виде энцефалита. Начинается она внезапным возбуждением, буйством и агрессией, нарушением координации движений. Тем­пература тела нормальная. У телят раннего возраста некоторые штаммы вируса ИРГ вызы­вают остро протекающее заболевание ЖКТ, которое трудно дифференцировать от диспеп­сии и энтеротоксемии.

У больных животных клинически четко выражена респираторная форма; генитальная форма часто протекает незаметно. Резкая физическая нагрузка как стресс может вызывать сдвиги в иммунном состоянии и размножении вируса, влиять на функцию лимфоцитов.

Патологоанатомические изменения. При вскрытии животных, убитых или павших при острой респираторной форме, обычно обнаруживают признаки серозного конъюнктиви­та, катарально-гнойного ринита, ларингита и трахеита, а также поражения слизистых обо­лочек придаточных полостей. Слизистая оболочка носовых раковин отечна и гиперемирована, покрыта слизисто-гнойными наложениями. Местами выявляют разной формы и величи­ны эрозийные поражения. Гнойный экссудат скапливается в носовой и придаточной полос­тях. На слизистых оболочках гортани и трахеи - точечные кровоизлияния и эрозии. В тяже­лых случаях слизистая трахеи подвергается очаговому некрозу. В летальных случаях воз­можна бронхопневмония. В легких встречаются очаговые участки ателектаза. Просветы альвеол и бронхов в пораженных участках заполнены серозно-гнойным экссудатом. Интерстициальная ткань сильно отечна. При поражении глаз конъюнктива века сильно гипереми-рована, с явлениями отека, который распространяется и на конъюнктиву глазного яблока. Конъюнктива покрыта саловидным налетом. Часто в ней образуются сосочкообразные бу­горки размером около 2 мм. Местами на ней выявляют небольшие эрозии и язвочки.

При генитальной форме на сильно воспаленной слизистой оболочке влагалища и вульвы видны пустулы, эрозии и язвочки на разных стадиях развития. Кроме вульвовагинита, мож­но обнаружить серозно-катаральный или гнойный цервицит, эндометрит и значительно реже проктит. У быков-производителей в тяжелых случаях к пустулезному баланопоститу присоединяются фимоз и парафимоз.

Свежие абортированные плоды обычно отечны, с незначительными аутолитическими явлениями. На слизистых и серозных оболочках небольшие кровоизлияния. По прошествии более длительного срока после гибели плода изменения имеют более тяжелый характер; в межмышечной соединительной ткани и полостях тела скапливается темно-красная жид­кость, в паранхиматозных органах - очаги некроза.

При поражении вымени обнаруживают серозно-гнойный диффузный мастит. Поверх­ность разреза отечна, отчетливо гранулирована вследствие увеличения пораженных долек. При надавливании с неё стекает мутный гноеподобный секрет. Слизистая оболочка цистер­ны гиперемирована, набухшая и пронизана кровоизлияниями. Местами встречаются эро­зийные поражения слизистой с фибринозными наложениями. При энцефалитах в головном мозге гиперемия сосудов, отечность тканей и мелкие кровоизлияния .

Гистологические изменения. При респираторном синдроме выявляют острое ката­ральное воспаление слизистой оболочки верхних дыхательных путей, ярко выраженный . клеточный инфильтрат в её толще и подлежащей соединительной ткани, состоящий из нейтрофильных лейкоцитов и лимфоцитов. Мерцательный однослойный эпителий в пораженных участках разрушается до базальной мембраны. В первые 2 сут болезни в эпителиаль­ных клетках слизистой оболочки носовой полости, находящихся на границе с очагом пора­жения, можно обнаружить внутриядерные включения. В легких при бронхопневмонии на­блюдают межлобулярные отеки интерстициальной ткани, иногда кровоизлияния. Просветы альвеол и бронхов пораженных участков заполнены серозным экссудатом с примесью нейтрофильных лейкоцитов. В перибронхиальной интерстициальной ткани находят обильные лимфоцитарные инфильтраты.

В конъюнктиве век микроскопически наблюдают инъекцию кровеносных сосудов, ост­рый катаральный конъюнктивит, ярко выраженную гиперплазию лимфатических фоллику­лов. Многослойный «призматический» эпителий слизистой инфильтрирован лимфоцитами и нейтрофильными лейкоцитами, а в пораженных участках дегенерирован и опущен вплоть до базальной мембраны. В некоторых клетках выявляют внутриядерные включения.

Гистологические изменения в слизистой оболочке вульвы, преддверия влагалища и вла­галища характеризуются явлениями острого пустулезного вульвовагинита. В плоском мно­гослойном эпителии наблюдают мелкие очаговые дегенеративные изменения клеток глубо­ких слоев и образование на их месте пустул и пузырьков. Участки пораженной слизистой и её соединительно тканной основы сильно инфильтрированы нейтрофильными лейкоцитами и лимфоцитами, на месте лопнувших пустул эрозийные поверхности, покрытые гнойным экссудатом. В пораженных клетках эпителия внутриядерные включения. При благоприят­ных условиях заживление дефектов эпителия наступает на 14-е сут. Мелкие гиперемированные узелки на эпителии слизистой оболочки, остающиеся после заживления дефектов, пред­ставляют собой лимфатические фолликулы. В абортированных плодах гистопатология ха­рактеризуется мелкими очаговыми некрозами и кровоизлияниями в почках, легких, печени, головном мозге, желчном пузыре, матке, влагалище. Матка самки чаще почти совсем не по­ражена. В вымени находят резкое перерождение и десквамацию эпителия в просвет прото­ков и цистерны. Просветы альвеол заполнены экссудатом с примесью нейтрофильных лей­коцитов и клеток спущенного эпителия. В интерстиции органа обнаруживают отек и ин­фильтрацию клетками крови. В клетках плоского многослойного эпителия - внутриядерные тельца-включения. В головном мозге обнаруживают хорошо выраженный лимфоцитарный менингоэнцефалит. Ему сопутствуют периваскулярная лимфоцитарная инфильтрация в раз­личных отделах полушарий и мозжечка, сильная инъекция сосудов и отечность вещества мозга. У животных, которые погибают, в веществе мозга преобладают кровоизлияния, а при затяжном характере болезни - дегенеративные изменения нервных клеток.

ДИАГНОСТИКА

ИРТ диагностируют на основании клинико-эпизоотологических данных, патологоанатомических изменений в органах и тканях с обязательным подтверждением лабораторными методами. Латентную инфекцию устанавливают только лабораторными исследованиями. Лабораторная диагностика включает: 1) выделение вируса из патологического материала в культуре клеток и его идентификацию в РН или РИФ; 2) обнаружение АГ вируса ИРГ в па­тологическом материале с помощью РИФ; 3) выявление AT в сыворотке крови больных и переболевших животных (ретроспективная диагностика) в РН или РИГА. Для лабораторной диагностики ИРТ используют набор диагностикумов ИРТ КРС. Диагностику ИРТ проводят параллельно с исследованием материала на ПГ-3, аденовирусную, PC-инфекции и ВД-БС.

. Предварительный ди­агноз на ИРТ КРС ставят на основании положительных результатов обнаружения АГ в па­тологическом материале РИФ с учетом эпизоотологических и клинических данных, а также патологических изменений. Окончательный диагноз ставят на основании совпадения ре­зультатов РИФ с выделением и идентификацией вируса; совпадение результатов РИФ с об­наружением AT в 30% и более вторых проб сывороток в титрах не ниже 1:2 в РН и 1:26 в РИГА и обнаружением 4-кратного и более увеличения титра AT в парных пробах сыворо­ток. Предварительный диагноз ставят в вет лабораториях в течение 2-3 дн, окон­чательный - в течение 15-30 дн.

Выделить вирус из носовой полости, влагалища и с конъюнктивы удается с 5-го по 10-й дн, а ВНА - с 5-8-го дня после заражения. Более высокий титр AT наблюдается после 35 дн, затем начинается медленное снижение. Для выделения вируса ИРТ из бразильской спермы использовали 2 линии перевиваемых клеток МДВК и метод непрямой ИФ (67). Установле­но, что максимальное количество вируса выделяется во время подъема температуры тела на 4-7-й дн болезни и продолжался до 10-14 дн.

Индикация вируса

Обнаружение специфических телец-включений. В ядрах клеток эпителия поражен­ных слизистых оболочек носовой полости, вульвы, вагины и конъюнктивы находят специ­фические тельца-включения. Через 18-20 ч после заражения их можно обнаружить в клет­ках культуры, окрашенной гематоксилин-эозином.

Выделение вируса. Вирус выделяют в культурах клеток почек телят, почек эмбрионов телят, тестикул бычков. В настоящее время для выделения вируса ИРТ используют 2 линии клеток МДВК. В этой линии клеток выделяли вирус из бразильской коммерческой спермы с признаками ЦПЭ и подтверждением методом прямой ИФ.

Экспресс-методы индикации. Для обнаружения вируса ИРТ применен метод молекулярной гибридизации с использованием радиоак­тивно меченых ДНК-зондов. Однако более перспективным является применение нерадиоак­тивного метода детекции вирусной ДНК. Описаны выявленные последовательности BHV-1 гибридизацией in situ с помощью меченного биотином ДНК-зонда. Предложенный зонд также имел существенный недостаток, поскольку неспецифически связывался с ДНК вируса БА. Поэтому разработан нерадиоактивный метод детекции вируса ИРТ на основе высокочувствительного зонда, меченного биотином. Время тестирования биотинилированного зонда составляет около суток, что существенно меньше по сравнению с вирусологиче­ским тестированием (до 40 дн). Наиболее важным представляется использование биотинилированного ДНК-зонда в случае выявления вируса в период карантинирования вновь заве­зенных животных, а также для обнаружения заболевания на ранних стадиях и диагностики латентной формы ИРТ для выявления возможного содержания вируса ИРТ в сперме быков. Разработана также ПЦР для обнаружения герпесвируса типа 1 КРС.

Серологическая идентификация.

ИФ. Техника постановки её такая же, как и при диагностике аденовирусной инфекции КРС. Обращают внимание на свечение АГ в цитоплазме и перинуклеарной зоне неповреж­денных клеток. Ярко-зеленая флюоресценция в виде гранул или диффузного свечения цито­плазмы не менее чем в 10% клеток позволяет оценить препарат как положительный. Пред­варительный диагноз ставят при наличии не менее 30% положительных препаратов от об­щего количества исследованных проб. В мазках из влагалища и конъюнктивы специфиче­скую флюоресценцию отмечали через 24 ч, из препуция - через 48, из носа и трахеи - через 72 ч после заражения. Присутствие специфического АГ удается подтвердить заражением культуры клеток почки телят, в которой обнаруживается специфическая перинуклеарная и диффузная цитоплазматическая флюоресценция, свойственная ИРТ. Использование культу­ры клеток почки кролика позволяет освободиться от неспецифического свечения. Совпадаемость результатов ИФ и патологоанатомических изменений составляет 87%, а ИФ и вирусологических исследований - 44%. При параллельном исследовании сывороток в РН и РИГА результаты совпадали в 94% случаев. В полевых условиях РИФ оказалась поло­жительной в 18,5%, а метод вирусовыделения - в 15,9% случаев. РИФ можно использовать для экспресс-диагностики ИРТ с последующим подтверждением диагноза вирусологически­ми методами.

РН. При наличии ЦПД в культурах клеток, зараженных изолятом, и положительной ИФ проводят окончательное типирование вируса в РН, которую ставят общепринятым методом в первичной культуре ПЭК или перевиваемой линии клеток МДВК. Результаты РН учиты­вают по ЦПД вируса, для чего определяют титр типируемого изолята в присутствии специ­фической и отрицательной контрольной сывороток. Титр рассчитывают по методу Рида и Менча и выражают в ТЦДзо/мл. Затем вычисляют индекс нейтрализации. Видовую принад­лежность изолята устанавливают при разности в титрах вируса не менее 2 lg; при разности от 1 до 2 реакцию считают сомнительной, в этом случае её повторяют; при разности нейтрализации менее 1 реакцию считают отрицательной. При положительных ре­зультатах РН изолят считают  идентифицированным.

РТГА. Ставят её микрометодом при 4°С с 0,5-1%-ной взвесью эритроцитов белых мы­шей, разбавитель - трис-буферный р-р с 0,2% БСА. В качестве АГ используют культуральную жидкость, которую концентрируют ПЭГ-6000 или ультрацентрифугированием.

ELISA. Иммунопероксидазный метод можно использовать для исследования прижиз­ненно взятых нозофарингиальных мазков-отпечатков в клетках, полученных из носовых смывов. Кроме того, для лабораторной идентификации вируса ИРГ рекомендован непрямой антикомплементарный иммунопероксидазный метод НАИП. При световой микроскопии он обеспечивает четкое выявление вирусного АГ в цитоплазме инфицированных клеток в виде окрашенных в коричневый цвет образований, которые видны при увеличении в 140 раз. Специфичность показателей, полученных этим методом, подтверждается постановкой специальных иммунологических контролей. При постановке перекрестной иммунопероксидазной реакции с гетерологичными АГ эта реакция имеет выраженный видоспецифический характер: АГ реагирует только с гомологичной сывороткой. Эндогенная пероксидаза в куль­туре клеток ПЭК и LF не выявляется.

Таким образом, НАИП является перспективным при диагностике острых респиратор­ных вирусных инфекций КРС. При использовании его для индикации вируса ИРТ в культуре клеток ПЭК АГ выявляется через 18-22 ч после заражения. Три прямых серологических метода быстрого обнаружения вирусных АГ (ИФ, ИФА и ELISA) одинаково приме­нимы для обнаружения вируса во время лихорадки, но не на поздних стадиях болезни.

Идентификация с помощью монАТ антител. Иммунопероксидазный метод с исполь­зованием монАТ является более чувствительным и специфичным по сравнению с обычными методами выделения вируса. Помимо того, данный метод имеет преимущество в быстроте получения результатов. Быстрое подтверждение вируса ИРГ (инфекции) возможно ме­тодом культивирования его с последующим ИФА зараженной культуры с использованием монАТ. Проведена молекулярная характеристика южноамериканских изолятов герпес-вируса-1 (ИРГ) КРС с помощью монАТ и электрофореза в полиакриламидном геле с доде-цилсульфатом натрия.

Идентификация посредством рестрикционного анализа ДНК. Описаны методы клонирования фрагментов генома вируса ИРТ, выделение и характеристика рекомбинантного ДНК-зонда, которые позволяют определять вирус в клинических пробах. С помощью метода дот-блот-гибридизации выявлена ДНК вируса ИРГ в пробах спермы, полученной от серопозитивных животных, когда выде­ление вируса в культуре клеток давало отрицательный результат. Хороший результат также получен при использовании инфицированных культур клеток.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика. AT к вирусу ИРТ можно обнару­жить в сыворотках крови больных и переболевших животных в РН, РНГА и др. Для поста­новки ретроспективного диагноза используют парные пробы сывороток, взятые с интерва­лом в 3 нед. Результат серодиагностики учитывают по возрастанию титра AT в парных про­бах сыворотки, а также числа серопозитивных животных через указанный интервал.

РН. Ставят методом разведения испытуемых сывороток с постоянной дозой вируса в культуре клеток ПЭК или ТБ. Вирус предварительно титруют в культуре клеток. Заражен­ные и контрольные культуры инкубируют при 37°С, ежедневно учитывая ЦПД вируса, окончательный учет проводят на 5-7-е сут. Наибольшей чувствительностью обладает РН, основанная на 24-ч инкубации смеси вирус-сыворотка. Титром вируса считают об­ратную величину его наибольшего разведения, вызывающего ЦПД в 50% культур, который высчитывают по методу Рида и Менча, или Кербера и выражают в ТЦДзо/мл. Титры 1:32, 1.64 обнаруживаются редко. В неблагополучных по данной болезни стадах ВНА выявляют­ся у 12% клинически здорового скота. Ретроспективный диагноз на ИРТ ставят при 4-кратном и более приросте AT в пробах сывороток реконвалесцентов. В настоящее время широко используют микрометод РН.

РНГА. Биологическая промышленность нашей страны выпускает эритроцитарный диагностикум. РНГА ставят согласно методическим указаниям в микропанелях с U-образными лунками наборов микротитрования Такачи или Титертек по общепринятой методике. Ре­зультаты РНГА с используемыми сыворотками оценивают по титрам; положительные - 1:16 и выше, сомнительные - 1:8, отрицательные - 1:4, 1:2 и нулевые. Увеличение титров AT в парных сыворотках в 2-4 раза свидетельствует о наличии инфекции. Применяя РНГА, можно обнаружить AT в более ранний период инфекции, чем с помощью РН. Установлено соответствие результатов РНГА и РН в 95% случаев. Высокие титры чаще выявляли в РНГА. С её помощью быстрее, чем РН проводить тонирование AT к вирусу ИРТ. Титры AT были в 7-10 раз выше выявляемых в РН.

РДП. Не нашла широкого применения в диагностической практике, хотя многие иссле­дователи рекомендуют её использовать для серодиагностики ИРТ. Marchang (1982) считает, что диагностика по наличию ПА имеет ряд преимуществ по сравнению с РН: она проще и быстрее в постановке, чем РН. ПА обнаруживают вскоре после введения вируса в организм, но они быстро исчезают. По наличию ПА можно уловить недавно прошедшую инфекцию, в то время как ВНА длительно циркулируют в организме, и заболевание можно уловить только по парным сывороткам. При выявлении ПА лучше всего брать пробы крови на 8-й и последующие дни  болезни.

РТГА. Может использоваться для выявления и количественной оценки AT к вирусу ИРТ. Титр анти-ГА коррелирует с титром ВНА. Положительный результат РТГА уже в 1-ом разведении сыворотки (1:4) указывает на наличие AT к вирусу ИРГ в данной пробе сыворотки. 4-кратный и более прирост титров анти-ГА в парных пробах сыворотки является показателем активной инфекции.

ELISA. Широко применяют в Нидерландах, США, Великобритании, Швеции, странах бывшего СССР. Он оказался пригодным для обнаружения AT к вирусу ИРТ в молоке. Для этого достаточно получения проб смешанного молока от 5-10 коров. AT определяют после предварительного концентрирования в них Ig. Совпадаемость данных серологических реак­ций в пробах сыворотки крови и молока составляла 92,8%. С помощью метода можно оперативно определять иммунологический статус поголовья лактирующих коров це­лого региона, а также проводить обследование экспортируемых и импортируемых животных.

Предложен непрямой метод IgM-ELISA для определения недавней инфекции ИРТ. Ран­ние AT IgM выделены на 6-й да после заражения, к 9-му да происходил рост титра AT Ig, a к 13-му да - ВНА. У телят, привитых инактивированной вакциной, раннего иммунного от­вета не происходило - AT IgM не выявлялись, a IgM и ВНА появлялись позже, чем после заражения. Однако при этом следует иметь в виду, что наличие в сыворотке КРС ревматоидного фактора может привести к ложноположительньш результатам диагностики в IgM-ELISA. В этом случае предварительная обработка проб сыворотки антибычьими IgM позво­ляет избежать ложноположительных результатов. Тест IgM-ELISA имеет большую ценность в диагностике ИРГ. В группе позитивных сывороточных проб корреляция между ELISA и РИГА составляла 98,3%, a ELISA с ИФ - 95,7% .

ELISA с использованием монАТ. Основан на конкуренции между AT сыворотки кро­ви КРС и нейтрализующими мышиными монАТ. Для его проведения лунки микротитрационных панелей обрабатывают очищенным вирусом ИРГ, и после высушивания их можно использовать немедленно или хранить при - 20°С. В обработанные вирусом лунки панелей последовательно вносят неразведенную испытуемую сыворотку, специфические к вирусу ИРГ монАТ, конъюгированные пероксидазой, субстрат пероксидазы. Результаты реакции учитывают в спектрофотометре при А405. В случае положительной реакции связывание монАТ ингибируется AT сыворотки крови. Метод оказался намного чувствительнее и специ­фичнее РН.

Аллергическая проба. Установлено, что при экспериментальном заражении наступает аллергизация организма, проявляющаяся положительной кожной аллергической реакцией уже на 7-й день после заражения, а при вакцинации живой вакциной это происходит через 2 нед после вакцинации, при естественном заражении (спонтанные аборты) аллергизация также наступает быстрее. В Болгарии и ФРГ применяют кожно-аллергическую реакцию для выявления переболевших и вакцинированных животных.

С целью унификации методов дифференциальной диагностики болезней, проявляющих­ся с везикулярным синдромом, получены высокоактивные препараты для идентификации возбудителей ИРТ и ВД КРС. Использование этих праймеров при вирусологической экспер­тизе патологических материалов оказалось особенно полезным при смешанном течении ящура и указанных болезней. Применение ранее разработанных для диагностики ящура ме­тодов изготовления специфических АГ и антительных препаратов дает возможность изго­товления аналогичных по качеству диагностикумов при идентификации вирусов ИРТ и ВД и унификации для схемы дифференциальной диагностики основных болезней, протекающих с везикулярным синдромом.

                        ИММУНИТЕТ И СПЕЦЕФИЧЕСКАЯ ПРОФИЛАКТИКА.

Переболевание сопровождается стойким и длительным иммунитетом, который может передаваться потомству с AT молозива. Иммунитет у переболевших животных длится не менее 1,5-2 лет, однако у животных-реконвалесцентов, имеющих AT, состояние абсолютной иммунности бывает редко, и их следует рассматривать как потенциальный источник инфи-цирования других животных. Даже выраженный гуморальный иммунитет не предотвращает персистенции вируса. В случае реинфекции вновь происходит размножение и выделение ви­руса, хотя болезнь протекает без видимых клинических признаков. При возникновении по­вторного заболевания трудно бывает отличить реинфекцию от реактивации персистирующего вируса. Поэтому всех животных, имеющих AT к ИРТ, следует считать носителями виру­са, находящегося в состоянии латенции.

Слизистые оболочки респираторного и генитального трактов больных животных проду­цируют IgA и интерферон. AT в сочетании с комплементом ограничивают, но не исключают распространения вируса ИРТ в организме. В подавлении инфекции клеточный иммунитет при ИРТ более эффективный, чем гуморальный и в основном связан с Т-лимфоцитами и макрофагами. Инактивация ТК-гена снижает способность вируса (1-го типа) вызывать аборты у привитого КРС.

Живые вакцины. Живые вакцины при ИРТ отличаются большим разнообразием Только в США применяют 14 вариантов живых вакцин. Большинство из них - штаммы вируса, аттенуированные длительным пассированием в первичных культурах и перевивае­мых линиях клеток. В Бельгии и Японии применяют ts-мутанты. Живые вакцины при ин-траназально-внутримышечном применении обусловливают хороший локальный иммунитет и защиту животных от клинического проявления инфекции. При вакцинации живыми вак­цинами необходимо использовать такие штаммы, которые не способны к персистенции, ибо не исключается возможность возникновения рекомбинантных вариантов при взаимодейст­вии аттенуированного и вирулентного штаммов вируса. В качестве живой вакцины предло­жен дефектный по ТК иммуногенный мутант, способный персистировать в организме при­витых телят не менее 3-х мес и передаваться телятам без перехода в ТК-генотип.

В РФ и странах СНГ для профилактики ИРТ применяют живую вакцину ТК-А (ВИЭВ) Её вводят подкожно в дозе 2-10⁵ ТЦЦзо/мл. Иммунитет у привитых животных наступает на 5-7-й день после вакцинации и сохраняется не менее одного года. Широко применяют также живую бивалентную вакцину "Бивак", содержащую 2 вакцинных штамма: ПГ-3 и ИРТ Вакцина "Бивак" производится биофабрикой, она безвредна, иммуногенна.

Персистенция и экскреция аттенуированного штамма вируса обнаружены также при применении других живых вакцин. Особенно часто и длительно вакцинный штамм вируса ИРТ выделяется со спермой привитых быков. Введение живой вакцины во время эстрального периода может сопровождаться поражением яичников, а вакцинация в ранний период стельности прерыванием беременности.

Считается, что интраназальная вакцинация более эффективна, чем подкожная или внут­римышечная. При этом введении вакцинный вирус быстро - в клетки верхних дыхательных путей и глоточного кольца и усиливается синтез IgA и локальное образование интерферона., а при генитальном введении проникает в эпители­альные клетки влагалища или препуция. Размножаясь в указанных клетках, вирус может выделяться во внешнюю среду в течение 2-х нед.

Патентуется живая поливалентная вирус-вакцина из 5 типов аттенуированных вирусов наиболее широко распространенных в Японии и других странах: вирус ИРТ, ВД-БС, ПГ-3, PC-вирус и бычий аденовирус 7-го типа. Все компоненты приготовлены в клеточных куль­турах. Поливалентность препарата усиливает эффективность вакцинации КРС.

Рекомбинантные вакцины. В ген gill аттенуированного вакцинного штамма ИРТ (NY) dltk была встроена мономерная вставка эпигонов белка Р1 вируса яшура. Полученная модифицированная живая вакцина защищала телят от ИРГ и ящура. Получен также рекомбинант вируса ИРТ, экспрессирующий димерную вставку эпитопов виру­са ящура. Возможно получение рекомбинантов с 3-валентными вставками эпитопов вируса яшура серотипов О, А и С. Получена генно-инженерная вакцина из мутанта вируса ИРТ. Инактивированные вакцины. По степени разрушения АГ детерминант инактиванты располагаются следующим образом: Уф облучение, нагревание (56°С), р-пропилактон, формальдегид и димерэтиленинин. В РФ применяется инактивированная димерэтилениминовая вакцина из эпизоотического шт. 4016, в которой в качестве адъюванта используется аэросил. В Чехословакии используется формолвакцина с масляным адъювантом. Препарат применяется двукратно в дозе 2 мл с 4-нед ин­тервалом. У вакцинированных животных формируются гуморальные (1:128 - 1:256) и сек­реторные (1:2-1:8) AT. Наблюдалась корреляция между уровнем сывороточных AT и устой­чивостью телят к заражению. Однако вакцинация серонегативных телят не предупреждала у них постинфекционной латенции вируса, но препятствовала ей у ранее перенесших спон­танную инфекцию. Колостральный иммунитет длился 4-5 мес. Вакцинация телят инду­цировала сероконверсию лишь тогда, когда уровень материнских AT у них был очень низ­ким. Применение инактивированной вакцины против ИРГ среди 100% серопозитивных коров способствовало снижению числа случаев патологических состояний, ассоциирован­ных с инфекцией этим вирусом. Отмечено также и улучшение некоторых показателей вос­производства: повышение процента рождаемости, снижение количества случек, необходи­мых для оплодотворения, уменьшение числа спонтанных абортов. Уже после однократной вакцинации у коров и стельных нетелей обнаружено повышение титра AT к ИРТ (6-9 log независимо от тира AT до вакцинации). Инактивированные вакцины, как и живые, при­меняют двукратно с 2-3-нед интервалом. Эффективность инактивированных вакцин против ИРТ зависит от концентрации АГ и природы адъюванта. Для оценки иммуногенности вакцины против ИРТ можно использовать кроликов в качестве лабораторной модели. По титрам накопления ВНА у привитых внутримышечно кроликов судят о качестве вакцины. Высокоиммуногенна инактивированная вакцина против ИРТ с двухкомпонентным масляным адъювантом ВНИЯИ и ГОА-сапониновым адъювантом.

Субъединичные вакцины. Показано минимальное размножение вируса ИРТ в орга­низме животных, иммунизированных гликопротеином gIV, который может быть использо­ван в качестве субъединичной вакцины в сочетании со свободным от вируса лизатом инфи­цированных клеток. Субъединичную вакцину готовили в виде иммуностимулирующего комплекса (ИСКОМ) из вирулентного штамма вируса герпеса типа 4 КРС. Очищенный ви­рус обрабатывали 1%-ным l-o-h-октил-глюкопиранозидом в течение нескольких часов при 4°С, затем центрифугировали в ступенчатом градиенте сахарозы. После диализа осадок рас­творяли в фосфатном буфере. Препарат в дозе 50 и 100 мкг вирусных компонентов дважды вводили внутримышечно 4-мес телятам с интервалом в 4 нед. Через 2 нед после второй вак­цинации животных заражали интраназально вирулентным вирусом ИРТ. Все животные, иммунизированные ИСКОМ вакциной не заболели, вирус в носовом секрете не обнаружи­вался, титр ВНА составлял 1:3500 и выше. У телят, иммунизированных коммерческой вак­циной, наблюдали подъём температуры и наличие вируса в носовом секрете. При испы­тании на телятах не было выявлено корреляции между титром сывороточных ВНА и устой­чивостью к заражению.

Запатентован метод получения субъединичной вакцины на основе полипегггидов герпесвируса КРС 1-го типа. В качестве кандидата в вакцину использо­вали мажорный гликопротеин gIV вируса ИРТ КРС. Опытных животных вакцинировали дважды с 3 нед интервалом. Препарат индуцировал ВНА в сыворотке крови и в слизистой носовых путей. Иммунизация приводила к предупреждению развития клинических призна­ков заболевания при экспериментальном заражении разрешающей дозой вируса. Сравнение иммуногенности субъединичной и инактивированной вакцины с масляным адъювантом дало сходные результаты. Титр гуморальных AT у КРС после 1- и 2 кратного применения субъединичной вакцины был выше, чем при прививке инактивированной вак­циной. Секреторные AT формировались лишь после 2 кратной вакцинации и были равно­значными у животных, привитых обоими препаратами. В ФРГ имеется хороший опыт сочетанного применения живой и инактивированной вакцины против ИРГ. Живую вакцину вво­дили двукратно с интервалом в 6 нед сразу после установления диагноза. Спустя 7 мес 2 кратно с тем же интервалом вводили инактивированную вакцину. В результате такой вак-цинопрофилактики новых случаев заболевания не регистрировали. Спустя 4 г. после пре­кращения вакцинации животные оказались серонегативными. Авторы оценили предло­женную ими схему применения живой и инактивированной вакцин как эффективную для оздоровления поголовья от ИРТ.

Поскольку вирус ИРТ может приживляться и длительно персистировать в организме вакцинированных животных, трудно однозначно ответить на вопрос о значении специфиче­ской профилактики в оздоровлении хозяйств от ИРТ или точнее - можно ли путем система­тического применения вакцин освободить хозяйство от носительства полевых штаммов ви­руса. Имеются сообщения о том, что полного оздоровления можно достичь лишь в результа­те систематического (4-летнего) применения в хозяйстве инактивированной эмульгированной вакцины,.

Связь уровня антител с резистентностью животных. Полной связи между титрами гуморальных AT и невосприимчивостью к вирусу нет. Даже низкий уровень AT может за­щитить животное от заражения. Это кажущееся противоречие можно объяснить тем, что в устойчивости организма к инфекции большое значение имеют местные (секреторные) AT и другие факторы иммунитета. Вирус ИРТ в организме индуцирует синтез интерферона, кото­рый препятствует размножению вируса в клетках. Интерферон в высоких титрах обнаружи­вается в течение 7 да при внутривенном введении вируса. Установлено и локальное образо­вание интерферона в дыхательных путях при интраназальном и интратрахеальном зараже­ниях. Вакцинный вирус также обладает высокой интерфероногенной активностью. Наступ­ление ранней невосприимчивости у вакцинированных телят связано с появлением интерфе­рона. Видимо, выявление специфических AT в сыворотке крови не является точным инди­катором иммунитета, хотя остается критерием при иммунологической оценке. Большинство авторов считают, что ВНА в титре 1:2-1:4 защищают животных от заражения. Телята, имеющие индекс нейтрализации сыворотки крови 2,4 и 2,83±0,9 и титр AT в РИГА 1:232, клинически не реагировали на введение вирулентного вируса.

Связь титров антител с вирусоносительством и вирусовыделением. Иммунизация животных живыми вакцинами против ИРГ снижает, но не предотвращает латентной инфек­ции у КРС. Со временем титр поствакцинальных AT при ИРТ снижается, но так как вирус в организме переболевшего и вакцинированного животного может реактивироваться из ком­плекса вирус-антитело, то содержание AT колеблется. По-видимому, этим и обусловлено выделение персистирующего вируса. Даже у животных с высоким титром AT вирус ИРТ был выделен из миндалин и лимфоузлов. В качестве профилактичских мер рекомендуют ре­гулярное исследование проб сыворотки крови от быков-производителей на наличие AT, a материала из препуция - вируса.

Серологическая оценка поствакцинального иммунитета. Изучением иммуногенных свойств вирус вакцины против ИРГ на коровах установлено, что при 1 кратном введении препарата максимальный уровень AT отмечали через 1-2 мес после вакцинации. Через 6 мес титр AT в РИГА снижался вдвое, а через 9 мес он был на уровне иммунного фона. Динамика ВНА имела такую же закономерность. Однако ВНА на высоком уровне удержива­лись дольше. Повторная иммунизация приводила к повышению титра гуморальных AT. У телят, полученных от вакцинированных коров, титр гуморальных AT был выше, чем у их матерей. Пассивно передающиеся AT в сыворотке крови телят и секретах из носовой полости появлялись уже в 1 дн после потребления молозива. Титр их в секретах носовой полости в большинстве случаев не превышал 1:8 в первые 15-20 сут после рождения.  Длительность циркуляции поствакцинальных антител. У коров через 9 мес после прививки живой вакциной в РНГА с сывороткой крови AT не выявлялись. Колостральные АТ сохранялись в крови телят в достаточно высоком титре до 30 дн с последующим сниже­нием к 60-му дн. Эффективность вакцины против ИРТ в Венгрии долгое время определяли в тесте нейтрализации с сывороткой вакцинированных телят. В настоящее время предложенболее чувствительный метод. Коэффициент корреляции между титром в РН и ELISA составлял 0,789.

Серопрофилактика. Для серопрофилактики ИРТ, ПГ-3 и аденовирусной инфекции ги­периммунные поливалентные сыворотки удается получать на лошадях, которых иммунизи­руют АГ, инактивированными электрическим полем или лазерным излучением. АГ приме­няют с масляными адъювантами. Поливалентные сыворотки  применяют в промышленных комплексах по доращиванию и откорму молодняка КРС.

Меры борьбы. Про­ведение мероприятий, изложенных в наставлении по борьбе с ИРТ, где предусмотрены на­дежная, систематически проводимая диагностика (включая исследование спермы быков-производителей на племенных станциях), строгий контроль за перемещением скота и актив­ная профилактика обеспечивает создание устойчивого благополучия хозяйства в отношении ИРТ. Для обеспечения безинфекционного стада КРС проводится регулярное серологическое тестирование и удаление из стада инфицированных животных, вакцинация, дезинфекция и борьба с грызунами.

Ветеринарно-санитарная оценка продукции неразработана.

                                               Семейство: Flaviviridae.

Таксономическая структура семейства.

Семейство: Flaviviridae

 Род:      Flavivirus, Pestivirus, Hepacivirus

Особенности вириона.

Морфология. Вирионы сферической формы, имеют липидную оболочку; диаметр 40-60 нм. Капсид образован капсидным протеином (С), а оболочка содержит 2-3, мембранных протеина, кодируемых вирусом. Вцелом, общие структурные характеристики гепацивирусов сходны с таковыми флави- и пестивирусов.

Геном. РНК:  односпиральная, линейная, позитивная; размер 11 kb, 12,3 kb и 9,6 kb у флави-, пести- и гепацивирусов, соответствено. 3’-концевого поли(А)-трека нет. У вирусов рода Flavivirus по 5’-концу РНК есть кэп типа I.

Протеины.Все вирусы семейства имеют один небольшой основной капсидный протеин и 2 (Flavivirus и Hepacivirus) или 3 (Pestivirus) мембрано-ассоциированных протеина. В составе сиквенсов неструктурных протеинов определены мотивы, характерные сериновой протеазе, РНК хеликазе и РНК-зависимой РНК полимеразе, которые имеют сходную локализацию в геноме у вирусов всех трех родов.

 Другие компоненты вириона.Липиды (15-20% общей массы вириона у флавивирусов), образующие оболочку вириона, имеют клеточное происхождение. Липидные компоненты пести- и гепацивирусов не идентифицированы.

Углеводороды присутствуют в вирионе в виде гликолипидов и гликопротеинов.

Организация генома и репликация. Геномная РНК вирусов всех трех родов имеет сходную организацию. В инфицированных клетках обнаруживают только мРНК, которая имеет одну ORF, фланкированную по 5’- и 3’-концам некодирующими участками (noncoding regions, NCR), формирующими специфические вторичные структуры, необходимые для репликации генома. У флавивирусов инициация трансляции кэп-зависимая в случае, тогда как у пести- и гепацивирусов идентифицирован внутренний сайт входа рибосомы (internal ribosomal entry site, IRES). Вирусные протеины синтезируются как части полипротеина (более 3000 аминокислот), который подвергается ко- и посттрансляционному разрезанию вирусными и клеточными протеиназами. Структурные протеины расположены в N-концевой части полипротеина, а неструктурные – в остальной. Последние включают сериновую протеазу, РНК хеликазу и РНК-зависимую РНК полимеразу. Синтез РНК происходит в цитоплазме в ассоциации с мембранами через синтез негативных промежуточных форм.  Сборка вириона и приобретение оболочки происходит на внутриклеточных мембранах, частицы транспортируются в секреторных цитоплазматических везикулах и высвобождаются из клетки путем экзоцитоза.

 Антигенные свойства. Между вирусами разных родов антигенного родства нет. Перекрестная активность в серологических тестах наблюдается на внутриродовом уровне (Flavivirus, Pestivitus). Гепацивирусы антигенному анализу пока не поддаются.

Род: Flavivirus. Типовой вид: Yellow fever virus (YFV) (вирус желтой лихорадки).

Характерные особенности. Распространение флавивирусов происходит с участием членистоногих переносчиков (мокитов или клещей), в которых они активно репродуцируются. Некоторые флавивирусы являются этиологическими агентами зоонозов грызунов и летучих мышей, не связанных с участием членистоногих переносчиков.

Характеристика вириона. Морфология.Вирионы сферические; диаметр 50 нм. Различают две формы вирионов. Зрелые вирионы содержат два вирусных мембрано-ассоциированных протеина Е и М. Внутриклеточные незрелые вирусные частицы имеют в своем составе вместо М его предшественника – prM, который протеолитически разрезается во время созревания. Детальный структурный анализ был проведен в отношении вируса клещевого энцефалита (Tick-borne encephalitis virus, TBEV). Его мажерный оболочечный протеин Е формирует димеры, атомная структура которых определена с использованием методов кристаллографии в рентгеновских лучах (X-ray cristallography). Димеры протеина Е имеют палочковидную (цилиндрическую) форму и ориентированы параллельно мембране, т.е. не образуют спайко-подобных выступов (при своем нейтральном рН).Криоэлектронные микрофотографии дают основание полагать, что оболочка вириона и кор имеют икосаэдральную симметрию. Точная Mr вириона не определена, но расчетная, в соответствии с композицией вируса, составляет примерно 60х10⁶. Плавучая плотность в сахарозе составляет 1,19 г/см³, S_20w 200S. Вирус стабилен при рН 8,0, но быстро инактивируется при низких значениях рН, температуре выше 40 ^оС, при воздействии органических растворителей, детергентов, УФ лучей и g-облучении.

Геном. РНК:  односпиральная, позитивная, линейная; размер примерно 11 kb. 5’-конец имеет кэп типа I (m-7GpppAmp), предшествующий консервативному динуклеотиду AG. 3’-конец не имеет поли(А)-трека и заканчивается консервативным динуклеотидом CU.

Протеины.В состав вириона входит 3 структурных протеина: капсидный протеин (С), мажерный оболочечный протеин Е, и либо prМ (у незрелых вирионов), либо М (у зрелых вирионов). Атомная структура растворимых димерных форм протеина Е определена кристаллографией в рентгеновских лучах. Протеин Е является вирусным гемагглютинином и участвует в процессе связывании с рецептором и рН-зависимого слияния мембран (вируса и клетки) в процессе рецептор-медиированного эндоцитоза. В инфицированных клетках синтезируется 7 неструктурных протеинов: NS1, NS2А, NS2В, NS3, NS4А, NS4В, NS5. NS3 является мультифункциональным протеином. N-концевая треть протеина формирует вместе с NS2В комплекс вирусной сериновой протеиназы, участвующий в процессинге полипротеина. С-концевая часть NS3 содержит РНК хеликазный домен, участвующий в репликации РНК, а также обладает РНК-трифосфатазной активностью, которая, вероятно, используется в формировании 5’-концевой кэп-структуры вирусной РНК. NS5 является самым крупным и наиболее консервативным протеином флавивирусов. NS5 является РНК-зависимой РНК полимеразой, и также, предположительно, имеет мотив, определяющий метилтрансферазную активность, участвующий в метилировании 5’-кэп-структуры.

Другие компоненты вириона. Липиды (17% массы вириона) имеют клеточное происхождение. Углеводороды, составляющие 9% массы вириона (гликолипиды и гликопротеины) имеют композицию и структуру, зависимые от клеток-хозяина (позвоночных или членистоногих). Сайты N-гликозилирования присутствуют у протеинов prМ (1-3 сайта), Е (0-2 сайта) и NS1 (1-3 сайта).

Организация генома и репликация. В инфицированных клетках обнаруживают только одну вирусную мРНК, которая имеет одну ORF (более 10000 оснований), кодирующую все структурные и неструктурные протеины, фланкированную по 5’- и 3’-концам короткими некодирующими участками (NCR). Хотя нуклеотидные сиквенсы дивергентны, предполагаемая вторичная структура 5’- и 3’-NCRs консервативна у разных флавивирусов. NCRs имеют консервативные участки, различающиеся у флавивирусов, распространяемых москитами или клещами. Длина 3’-NCR вируса клещевого энцефалита может значительно варьировать (45-800 нуклеотидов) и, в некоторых случаях, содержать внутренний поли(А)-тракт. Синтез РНК происходит на мембранах перинуклеарного эндоплазматического ретикулума. После трансляции исходной геномной РНК, запускается процесс репликации РНК, начинающийся с синтеза комплементарных негативных цепей, которые затем используются в качестве матриц для образования полноразмерных позитивных молекул РНК. Они синтезируются по полуконсервативному механизму с образованием промежуточных (содержащих как двухцепочечные участки, так и вновь синтезированные одноцепочечные молекулы) и репликативных (дуплексы молекул РНК) форм. Синетез негативных цепей в клетках, инфицированных флавивирусами, продолжается в течение всего цикла репликации. Трансляция обычно начинается с первого AUG ORF, но у флавивируосв, передающихся москитами, может также начинаться со второго внутреннего AUG, расположенного на 12-14 кодонов ниже. Полипротеин процессируется клеточными протеазами и вирусной NS2B-NS3 сериновой протеазой с образованием зрелых структурных и неструктурных протеинов. Топология протеинов относительно эндоплазматического ретикулума и цитоплазмы определяется внутренними сигналами и специфическими стоп-трансферными сиквенсами (stop-transfer sequences). Пролиферация и гипертрофия внутриклеточных мембран является характерной особенностью клеток, инфицированных флавивирусами. Репликативные комплексы осаждаются с мембранными фракциямии экстракта инфицированных клеток. Первоначально вирусные частицы могут быть обнаружены в шероховатом эндоплазматическом ретикулуме, который считается местом сборки вирионов. Затем такие незрелые вирионы транспортируются через мембранные системы секреторного аппарата клетки к ее поверхности, где происходит их экзоцитоз. Непосредственно перед высвобождением вириона протеин prМ разрезается фуриновыми или фурино-подобными клеточными протеазами с образованием зрелых вирионов. Инфицированные флавивирусами клетки высвобождают также неинфекционные субвирусные частицы, имеющие более низкий (по сравнению с целым вирионом) коэффициент седиментации (70 S против 200 S) и проявляющие гемагглютинирующую активность (медленно седиментирующий гемагглютинин, SHA).

Антигенные свойства. Все флавивирусы серологически родственны, что может быть продемонстрировано в ELISA или реакции ингибиции гемагглютинации с использованием поли- и моноклональных антител. Реакция нейтрализации более значима и может быть использована для определения отдельных серокомплексов более близкородственных флавивирусов. Оболочечный протеин Е является основной мишенью для нейтрализующих антител и вызывает образование протективного иммунитета. Протеин Е индуцирует, также, образование перекрестно реагирующих, но не обладающих нейтрализующей активностью антител. Антигенные сайты, участвующие в нейтрализации определены для всех трех структурных доменов протеина Е. АТ, специфичные prМ, взаимодействуют, в основном, с нейтрализованными вирионами.

Биологические особенности. Спектр естественных хозяев. Флавивирусы могут инфицировать различные виды позвоночных и, во многих случаях, членистоногих. Некоторые вирусы имеют ограниченный спектр восприимчивых хозяев-позвоночных (например, только приматы); другие могут инфицировать широкий спектр видов (млекопитающих, птиц и др.). Членистоногие обычно инфицируются во время прокормления на хозяине (позвоночном), во время виремии, или при ее отсутствии (последнее описано в отношении флавивирусов, передающихся клещами).

Пути распространения и родство по переносчику. Большинство флавивирусов являются арбовирусами и поддерживаются в природе путем передачи между кровососущими членистоногими (переносчиками) и позвоночными (хозяевами). Примрено 50% известных флавивирусов распространяются москитами, 28% - клещами, а остальные являются зоонозными агентами, распространяющимися между грызунами и летучими мышами при отсутствии известных векторов. В некоторых случаях цикл передачи не идентифицирован.

Географическое распространение. Флавивирусы распространены повсеместно, но некоторые виды встречаются в определенных эндемичных или эпидемичных районах, например, вирус желтой лихорадки (YFV) – в тропических и субтропических областях Африки и Южной Америки, вирус Денге (DENV) – в тропических областях Азии, Океании, Африки, Австралии и Америки, вирус японского энцефалита (JEV) – в Юго-Восточной Азии, вирус клещевого энцефалита (TBEV) – в Европе и Северной Азии.

Ассоциация с болезнью. Более 50% известных флавивирусов асоциированы с болезнями человека, включая такие опасные патогены как YFV, DENV (тип 1-4), JEV и TBEV. Болезни, вызываемые флавивирусами, могут быть ассоциированы с симптомами поражения центральной нервной системы (менингиты, энцефалиты), лихорадкой, артралгией, сыпью и геморрагической лихорадкой. Некоторые флавивирусы патогенны для домашних и диких животных (лошадей, свиней, овец, собак, индеек, куропаток, андатр) и вызывать экономически значимые болезни.

Критерии подразделения на виды внутри рода. Видовую принадлежность флавивирусов определяют по следующим критериям: нуклеотидный и аминокислотный сиквенс; антигенные свойства; географическое распространение; переносчики; естественные хозяева; ассоциация с болезнью; экологические характеристики.

Вирусы данного рода сгруппированы по серологическим характеристикам и в соответствии с преобладающими векторами.

Виды (53 вида):

Предполагаемые виды: Tamana bat virus (TABV), Cell fusing agent virus (CFAV)[M91671].

Род: Pestivirus. Типовой: Bovine viral diarrhea virus1(BVDV1)(в.вирусной диареи КРС 1).

Характерные особенности. Пестивирусы кодируют два уникальных продукта генов. Первый протеин ORF – неструктурный протеин N^pro, обладающий аутопротеолитической активностью, отвечающей за высвобождение из вновь образованного полипротеина. Один из трех вирусных оболочечных гликопротеинов E^rns обладает РНКазной активностью.

Характеристика вириона. Морфология. Вирионы сферические, оболочечные; диаметр 40-60 нм. На поверхности вириона различают кольцевидные (ring-like) субъединицы размером 10-12 нм. Структура и симметрия кора не изучена.

Точная Mr вириона не определена, но расчетная, в соответствии с композицией вируса, составляет примерно 60х10⁶. Плавучая плотность в сахарозе составляет 1,10-1,15 г/см³, S_20w 140-150S. Инфекционность вируса стабильна в пределах относительно широкого спектра рН, но быстро снижается при температуре выше 40 ^оС и воздействии растворителей и детергентов.

Геном.РНК:  односпиральная, позитивная, линейная; размер примерно 12,3 kb. Данных, свидетельствующих о наличии кэпа по 5’-концу, нет. 3’-конец не имеет поли(А)-тракта. Геномная РНК содержит одну ORF, охватывающую почти весь геном вируса. У некоторых цитопатогенных штаммов BVDV-1 в определенных участках генома (NS2 или по месту перехода NS2 в NS3) идентифицированы небольшие вариабельные интегрированные фрагменты нуклеиновой кислоты (вирусного или клеточного происхождения). Другие цитопатогенные изоляты BVDV имеют генетические дуплексы, охватывающие целиком или частично участки генома, кодирующие протеины N^pro или NS3, что приводит к увеличению вирусного генома до 16,5 kb. Во всех этих случаях сохраняется одна большая ORF. Цитопатогенные вирусы могут также образовываться при делециях больших участков генома. Такие дефектные геномы могут сохраняться в присутствии интактного хелперного вируса (помощника).

Протеины.В состав вириона входит 4 структурных протеина: основной нуклеокапсидный протеин (С), и 3 оболочечных гликопротеина E^rns, Е1 и Е2. Все три глкопротеина существуют в виде межмолекулярных комплексов, связанных дисульфидными связями: гомодимеры E^rns, гетеродимеры Е1-Е2, гомодимеры Е2. E^rns обладает РНКазной активностью и является уникальным продуктом пестивирусов, не найденым у вирусов других родов семейства. Пестивирусы кодируют 7-8 неструктурных протеинов (NS). Протеин N^pro, также уникальный для пестивирусов, является протеиназой, аутокаталитически высвобождающейся от вновь образованного полипротеина. Неструктурный протеин р7, вероятно, участвует в созревании вируса. Протеин NS2-3 многофункциональный. N-концевая область (40%, или NS2) является гидрофобной и содержит мотив “цинкового пальца” (zinc finger motif), что свидетельствует о его участии в связывании РНК или репликации. С-концевая область (60% или NS3) функционирует как сериновая протеиназа, участвующая в процессинге полипротеина и как РНК-хеликаза/NTPаза, вероятно, участвующая в репликации РНК. NS2-3 обнаруживается у нецитопатогенных BVDV. У цитопатогенных изолятов BVDV, вируса пограничной болезни овец (BDV) и классической чумы свиней (CSFV) NS2 и NS3 могут продуцироваться в добавление к NS2-3. Протеин NS4A действует как кофактор для NS3-протеиназной активности. Роль NS4B неизвестна. NS5A является единственным фосфорилированным пестивирусным протеином и, вероятно, участвует в репликации РНК. NS5B обладает активностью РНК-зависимой РНК полимеразы.

Другие компоненты вириона.Имеет липидную оболочку, но по композиции липидов данных нет. Все вирусные оболочечные гликопротеины имеют N-связанные гликаны.

 Организация генома и репликация. Геномная РНК состоит из одной ORF, кодирующей полипротеин примерно в 4000 аминокислот, предшествующей ей 5’-NCR (360-385 нуклеотидов), и следующей за ней 3’-NCR (230 нуклеотидов). Порядок расположения генов:5’-N^pro-C-E^rns-E1-E2-p7-NS2-3(NS2-NS3)-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-3’.

Репликация пестивирусов инициируется рецептор-опосредованным эндоцитозом, в котором участвуют один или более поверхностных клеточных молекул и вирусных гликопротеинов E^rns и E2. После эндоцитоза и раздевания геномная РНК служит в качестве мРНК. Субгеномных молекул мРНК нет. Инициация трансляции происходит по кэп-независимому внутреннему инициирующему механизму с использованием внутреннего сайта входа рибосомы (IRES), расположенного в 5’-NCR РНК. Процессинг полипротеина осуществляется ко- и посттрансляционно за счет клеточных и вирусных протеиназ. Неструктурный протеин N^pro (первый протеин ORF) отрезается аутопротеолитически от вновь образованного полипротеина по сайту N^pro/С. Последующие разрезания полипротеина, сопровождающиеся образованием структурных протеинов C, E^rns, E1 и E2, вероятно медиируется клеточными сигнальными пептидазами. Транслокация гликопротеина в эндоплазматический ретикулум происходит, вероятно, при участии внутренней сигнальной последовательности, возможно внутри протеина C. Разрезание между Е2 и р7 происходит не полностью, что приводит к образованию внутриклеточных форм Е2 с разными С-концами. В зависимости от вируса NS2-3 остается интактным (нецитопатогенные вирусы) или обнаруживаются вместе с N- и С-концевыми продуктами NS2 и NS3 (цитопатогенные вирусы). Механизм образования NS3 включает события рекомбинации РНК. Цитопатогенные BVDV имеют генетические вставки, делеции, дуплексы или реорганизации, что, в итоге, приводит к продукции NS3. NS3 (или NS2-3 у нецитопатогенных вирусов) обладает активностью сериновой протеазы, ответственной за весь последующий процессинг полипротеина. NS4A облегчает разрезание, обусловленное NS3, по сайтам NS4B/5A и 5A/5B.

Репликация РНК происходит в ассоциации с внутрицитоплазматическими мембранами, предположительно в репликационных комплексах, образованных вирусной РНК и вирусными неструктурными протеинами. Обнаруживаются репликативные формы РНК пестивирусов. Соотношение позитивных и негативных цепей РНК в клетках, через 12 часов после инфицирования, равно 10. Синтез РНК не ингибируется актиномицином D. Созревание вируса изучено не достаточно. Вирусные протеины не обнаружены на поверхности клетки, что свидетельствовует о созревании вирионов во внутриклеточных везикулах, и последующем высвобождении путем экзоцитоза. Значительное количество инфекционных вирусных частиц остаются клеточно-ассоциированными. Синтез клеточных РНК и протеинов продолжается в процессе инфекции.

Антигенные свойства.Пестивирусы антигенно родственны, и имеют общие эпитопы, участвующие в перекрестной активности. Отдельные антигенные детерминанты были определены с использованием моноклональных антител. Антигенные вариации особенно хорошо просматриваются между изолятами BVDV. N-концевая часть Е2 содержит гипервариабельный, в антигенном отношении, участок. Профиль взаимодействия с моноклональными антителами согласуется генетическим родством вирусов. У инфицированных животных вырабатываются антитела, специфичные двум структурным гликопротеинам (E^rns и Е2) и протеину NS3, тогда как на все остальные протеины ответ развивается очень слабый или не развивается совсем. Протеины E^rns и Е2 способны индуцировать протективную защиту независимо друг от друга. Моноклональные антитела, специфичные этим протеинам могут обладать нейтрализующей активностью. Антитела, специфичные NS3, нейтрализующей активностью не обладают.

Биологические особенности. Спектр естественных хозяев. Пестивирусы инфицируют свиней и жвачных, включая КРС, овец, коз и диких жвачных. Беспозвоночных хозяев нет.Пути распространения. Передача вируса происходит путем прямого и непрямого контактов. Трансплацентраная и конгенитальная передача происходит у всех видов животных. Патогенность. Пестивирусные инфекции могут протекать субклинически и сопровождаться различными клиническими состояниями, включая диарею, острый геморрагический синдром, острую фатальную болезнь и изнуряющую болезнь. Трансплацентарное инфицирование может приводить к смерти плода, врожденным нарушениям или развитию пожизненной персистентной инфекции. Фатальная болезнь слизистых случается у КРС, персистентно инфицированного нецитопатогенным BVDV, который суперинфицируется цитопатогенным вирусом.  Экспериментальная инфекция. В экспериментальных условиях ни у каких видов животных, кроме естественных хозяев вызвать инфекцию BVDV или BDV не удалось. Однако CSFV был адаптирован к репродукции у кроликов.  Культуры клеток. Клетки, полученные от естественных хозяев (КРС, свиней, овец) поддерживают репликацию вируса. Большинство вирусных изолятов нецитопатогенны и создают персистентную инфекцию в культуре клеток. Инфекционный нецитопатогенный BVDV часто присутствует в продуктах сыворотки крови КРС, используемых для культивирования клеток. Цитопатогенные BVDV, которые возникают у животных во время персистентной инфекции, способны к бляшкообразованию и ЦП действию. Гемагглютинация. Пестивирусы гемагглютинирующей активностью не обладают.

Критерии подразделения на виды внутри рода.Видовую принадлежность пестивирусов определяют по следующим критериям: родство по нуклеотидному сиквенсу; серологическое родство; вид животного-хозяина (от которого выделен изолят).

Подразделение пестивирусов на виды проводится по нескольким параметрам, и их родству с типовыми вирусами видов, идентифицированных, на данный момент (BVDV-1: NADL; BVDV-2: 890; BDV: BD31 и CSFV: Alfort/187). Родство по нуклеотидному сиквенсу является важнейшим критерием подразделения пестивирусов на виды. Например, сиквенсы 5’-NCR между типовыми вирусами четырех известных, на данный момент, видов различаются на 15%. В большинстве случаев степень гомологии по 5’-NCR позволяет дифференцировать виды. Однако иногда родство по нуклеотидному сиквенсу может быть непоянтным (двусмысленным) и должно быть подкреплено дополнительными сравнительными анализами. Сывортка крови переболевших животных, содержащая антитела против данного вида пестивирусов (например, BVDV-1), обычно имеет титр нейтрализующей активности в несколько раз выше в отношении вирусов соответствующего вида (BVDV-1), чем против вирусов других видов. Наконец, различия по виду животного, от которого выделен вирус, могут (но не всегда) помочь в определении видовой принадлежности. Например, BVDV-1 и CSFV считаются разными видами, так как они отличаются друг от друга по (1) не мнее чем 25%-му различию нуклеотидного состава (по полному геному), (2) не менее чем 10-ти кратным различиям по титрам нейтрализации, при проведении реакции перекрестной нейтрализации с использованием поликлональных антител (сывороток иммунных животных), и (3) по спектру восприимчивых видов животных-хозяев (в естественных условиях CSFV инфицирует только свиней, тогда как BVDV-1 инфицирует как жвачных, так и свнией). Виды (4 вида):

Предполагаемые виды: Pestivirus of giraffe.

Род: Hepaсivirus. Типовой вид: Нepatitis C virus (HCV) (вирус гепатита С).

Характерные особенности.Гепацивирусы распространяются между людьми, через контакт с контаминированной кровью или продуктами крови. Беспозвоночных переносчиков (векторов) нет. Гепацивирусы отличаются от флави- и пестивирусов неспособностью к эффективному накоплению в культурах клеток и по тому, что протеин-предшественник, состоящий из неструктурных (NS) протеинов 2 и 3, аутокаталитически разрезается по сайту соединения NS2-3 по цинк-зависимому механизму.

Характеристика вириона. Морфология.Вирионы сферические, оболочечные; диаметр около 50 нм. Вирусный кор сферический, около 30 нм в диаметре. Инактивируются при обработке хлороформом. Детально структура вириона не изучена.

Плавучая плотность в сахарозе составляет 1,06 г/см³, если вирус выделен из сыворотки крови при остром течении инфекции, и 1,15-1,18 г/см³, если вирус выделен из сыворотки крови при хроническом течении инфекции. Более низкая плотность является результатом физической ассоциации вирионов с сывороточными низкоплотностными липопротеинами. Более высокая плотность появляется в следствие связывания вируса с сыворотчными антителами. Вирус гепатита С (HCV), полученный из культуры клеток, имеет плавучую плотность в сахарозе 1,12 г/см³. S_20w 150S. Вирионы стабильны в буфере рН 8,0-8,7, но чувствителльны к нагреванию, органическим растворителям и детергентам.

Геном.РНК:  односпиральная, позитивная, линейная; размер примерно 9,6 kb. 5’-конец содержит внутренний сайт входа рибосомы (IRES) и имеет длину 340 нуклеотидов. 3’-конец сложный и содержит вариабельные участки (примерно 50 нуклеотидов), полипиримидиновый, различающийся по длине, участок (примерно 100 нуклеотидов) и высоко консервативный концевой участок (около 100 нуклеотидов).

Протеины.В состав вириона входит как минимум 3 протеина: коровый (нуклеокапсидный) протеин С (р19) и два оболочечных протеина Е1 (gp31) и Е2 (gp70). Дополнительный протеин р7 неполностью отрезается от предшественника Е2, что приводит к образованию Е2-р7 и р7, хотя не ясно, являются ли они структурными компонентами вириона. Два оболочечных протеина образуют в составе вириона гетеродимеры (вероятно нековалентно связанные). Распознаваемые неструктурные протеины включают: NS2 (Mr 21х10³) – протеин, который до разрезания является частью цинк-зависимой протеиназы, соединяющей NS2 и NS3, и медиирующей аутокаталитическое разрезание по месту соединения NS2/NS3; NS3 (Mr 70х10³) – протеин с активностью сериновой протеазы, хеликазы и NTP-азы (протеиназная активность используется для разрезания по сайтам между оставшимися неструктурными протеинами); NS4А (Mr 6х10³) – кофактор, существенный для активности сериновой протеазы NS3; NS4В (Mr 27х10³) (функция не известна); NS5А – сериновый фосфопротеин, с неясной функцией (Mr 56-58 х 10³, в зависимости от степени фосфорилирования); NS5В (Mr 68х10³) – протеин с активностью РНК-зависимой РНК-полимеразы.

Другие компоненты вириона.Наличие липидов не было показано непосредственно.  Однако наблюдения по удалению вирусной оболочки и потере инфекционности при воздействии растворителей или детергентов свидетельствуют о присутствии липидов.

Углеводы также не идентифицировнны непосредственно, но наличие сайтов гликозилирования в предполагаемых кодирующих областях генов Е1 и Е2 и демонстрация углеводов, ассоциированных с продуктами этих двух генов, экспрессированных как рекомбинантные протеины, согласуется с наличием углеводов в составе вирионов.

Организация генома и репликация. Геномная РНК состоит из одной ORF, кодирующей полипротеин примерно в 3000 аминокислот. Порядок расположения генов: 5’-C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-3’. Все 3 структурных протеина (С, Е1 и Е2) кодируются в аминоконцевой части ORF. Непосредственно 3’ находится мелкий протеин р7, функция которого неизвестна. Идентифицированные структурные протеины кодируются в 3’-части ORF. Репликация изучена плохо, но есть данные, что она происходит в ассоциации с внутрицитоплазматическими мембранами. Репликативные формы вирусной РНК были обнаружены в ткани печени. Геномная РНК транслируется в полипротеин, который быстро процессируется ко- и посттрансляционно. Инициация трансляции происходит через IRES, расположенный внутри 5’-NCR, который также содержит несколько, расположенных близко друг к другу, AUGs. Транслокация структурных гликопротеинов в эндоплазматический ретикулум вероятно происходит с использованием внутренних сигнальных сиквенсов. Разрезание структурных протеинов осуществляется клеточными сигнальными пептидазами; вирусные протеазы разрезают все соединения между неструктурными протеинами. Сборка вирионов происходит, вероятно, путем почкования в везикулы.

Антигенные свойства.Вирусспецифические антитела к структурным протеинам (С, Е1 и Е2) и неструктурным протеинам (в основном NS3, NS4 и NS5) могут быть выявлены, с использованием рекомбинантных антигенов, в крови людей, инфицированных HCV. В формировании гуморального иммунного ответа участвуют конформационно-зависимые и линейные эпитопым HCV. Значительная гетерогенность по геному отражается в некоторой серологической гетерогенности гуморального иммунного ответа, особенно в отношении продукта гена NS4. Наиболее широкая гетерогенность обнаружена по N-концевым 27 аминокислотам Е2 (гипервариабельный участок 1, HVR-1). Есть данные, что HVR-1 является нейтрализующим эпитопом протеинов HCV и, что уклоняющиеся от нейтрализации варианты (эскейп-варианты) селектируются под влиянием иммунного ответа хозяина. Могут быть другие эпитопы нейтрализации, но они еще не определены. Клеточно-опосредованный иммунный ответ на все протеины HCV был показан, но его значимость не ясна. Однако есть свидетельства, что такой ответ ассоциируется с улучшением или прекращением инфекции. Из-за отсутствия системы культуры клеток, приемлемой для культивирования HCV, нет возможности широкого использования реакции нейтрализации in vitro. Отсутствие протективного иммунитета у шимпанзе, ранее инфицированных HCV, на реинфицирование другим штаммом HCV или даже тем же (сходные данные получены по естественной инфекции у людей), свидетельствует, что определение серотипов HCV затруднительно.

Биологические особенности.Спектр естественных хозяев. Естественным хозяином и резервуаром HCV является человек. Экспериментально инфекция передавалась шимпанзе. Других хозяев не идентифицировано.Пути распространения. Вирус гепатита С распространяется почти исключительно парентерально, через кровь. Эффективный скрининг донорской крови и использование инактивирующих процедур могут значительно снизить уровень распространения HCV через кровь и ее продукты, однако и другие пути заражения, особенно через нестерильные шприцы, остаются важнейшими факторами риска в развивающихся странах. Сообщалось о возможности инфцирования при половом контакте и перинатально. Географическое распространение. Вирус гепатита С распространен повсеместно. Данные (по детекции антител) свидетельствуют, что в развивающихся странах около 0,1-2,0% населения могут быть инфицированы HCV, но в некоторых уровень достигает 20%. Высокий уровень антителоносителей, может быть результатом использования контаминированных игл и шприцов.  Примерно 3% населения Земли инфицировано HCV, что обусловливает развитие болезни у 170 миллионов человек.

Патогенность. Течение инфекции варьирует от субклинического до (редко) скоротечного (молниеносного). Персистенция вируса встречается в 80% случаев инфицирования. Из них около 20% переходит в хронический острый гепатит и цирроз. Персистентные инфекции эпидемиологически связаны с первичным раком печени, криптогенным циррозом и некоторыми формами аутоиммунного гепатита. Проявления HCV-инфекции вне печени сопровождаются смешанной криоглобулинемией в ассоциации с мембранопролиферативным гломерулонефритом и  аутоиммунными состояниями. Тканевый тропизм. Сообщалось о репродукции вируса гепатита С в некоторых линиях клеток, происходящих из гепатоцитов и лимфоцитов, но накопление вируса было недостаточным для практического использования этих систем. In vivo HCV реплицируется в гепатоцитах при кажущемся отсутствии цитопатогенного эффекта.

 Критерии подразделения на виды внутри рода. На основе гетерогенности нуклеотидного состава генома изолятов, полученных из разных регионов мира, вирус гепатита С был классифицирован на 6 генетических групп. Они были названы генотипами HCV 1-6. Генотипы различаются между собой на нуклеотидном уровне на 25-35%. Генотипы 7-11 описаны, но более широкий генетический анализ переместил вирусы генотипов 7-9 и 11 в генотип 6, а генотип 10 – в генотип 3. Шесть генотипов, в свою очередь, были подразделены еще на 100 субтипов, которые раличаются между собой на нуклеотидном уровне на 15-25%. Хотя генотипы различаются, подразделение на субтипы менее ясное, из-за перекрывания по степени гетерогенности. Было предложено

подразделять (и классифицировать) основные генетические группы HCV на генотипы 1-6. Из-за невозможности, серотипирования изолятов HCV, и из-за отсутствия других таксономических характеристик основных генотипов, за исключением, географического распространения, все 6 генетических групп HCV, в настоящее время, составляют 1 вид.

Неклассифицированные вирусы семейства.

На основании данных по организации генома и генетического сходства с уже известными членами семейства 3 группы вирусов были предварительно отнесены в семейство Flaviviridae.

Обратите внимание на лекцию "3 Формирование Древнерусского государства в IX-X веках".

Типовой вид: GB virus A (GBV-A)  [U22303]. GBV-A-like agents (GBV-A-like agents).

Характерные особенности.GBV-A и GBV-A-подобные агенты (GBV-A-like agents) представляют группу родственных вирусов, идентифицированных не менее, чем у 6 видов обезян Америки (Нового Света). Они не вызывают гепатитов у естественных хозяев или других восприимчивых видов животных. Место или орган, в котором происходит репродукция, не определены; хотя вирус передается через кровь, естественные пути передачи неизвестны. Эти вирусы имеют сходную с гепацивирусами организацию генома и отдаленное генетическое сходство, но отличаются отсутствием полного гена капсидного протеина и организацией 3’-NCR, которая имеет менее сложную структуру.

Типовой вид: GB virus В (GBV-В) [U22304].

Характерные особенности. GBV-В был выделен от обезьян тамаринов (tamarin monkey), но их пассажная история свидетельствует о происхождении от человека. Передается через кровь и вызывает гепатиты у некоторых видов обезьян Америки. По организации генома и сходству сиквенсов GBV-B наиболее близок гепацивирусам.

Типовой вид: GB virus С/Hepatitis G virus  (GBV-HGV) [U22304] (HGV-1)       [044402].

Характерные особенности.GBV-C/HGV генетически гетерогенный вирус, имеющий происхождение от человека. Передается через кровь и ее продукты, но могут быть и другие пути распространения. Хотя описанный, первоначально, как вирус гепатита (поэтому и альтернативное название Hepatitis G virus), данные о его патогенности и месте репродукции остаются противоречивыми. Хотя и отдаленно, по признакам организации генома и генетическому сходству GBV-C наиболее близок группе вирусов GBV-A.