Введение

                                             Введение.

Вирусы  открыты в конце прошлого столетия Бейеринком и Д.И.Ивановским (1892 г. - вирус табачной мозаики),  Лефлером и Фрошем (1897 г. - вирус ящура) и Ридом и Кэрролом (1898 г. - вирус желтой лихорадки) на основе измерения их единственной физико-химической характеристики - способности проходить через стерилизующие керамические фильтры, т.е. фильтруемости. Именно это свойство первоначально использовалось для их классификации в качестве отдельной, особой группы патогенных микроорганизмов. Слово вирус (virus), которым были названы новые агенты, в исходном смысле означало заразный яд и исторически в научном контексте впервые было применено врачом эпохи Возрождения Петрусом Форестусом  (1522-1597). Окончательное определение вирусов как организмов и генетически обособленных индивидуумов  дано А.Львовым (1957, 1962 гг.). Вирусы составляют условное «третье царство» Vira, наряду с царствами про- и эукариотов.

       В предлагаемом учебном пособии представленны наиболее характерные вирусы  из основных вирусных семейств.

Семейство: Reoviridae.

Таксономическая структура семейства.

Семейство: Reoviridae

 Род: Orthoreovirus, Orbivirus, Rotavirus, Coltivirus, Aquareovirus,Cypovirus, Fijivirus,

                    Phytoreovirus, Oryzavirus.

Характеристика вириона.

Рекомендуемые материалы

Морфология. Вирион икосаэдральной симметрии, но может выглядеть сферическим. Состоит из капсида, сформированного концентрическими протеиновыми слоями, в виде 1-3 четких капсидных чехлов, имеющих внешний диаметр 60-80 нм. Вирусы девяти родов можно подразделить на две группы. Одна группа содержит вирусы, интактные вирусные частицы (или коры) которых содержат относительно большие выступы (spikes) или “башенки”, расположенные на 12-ти вершинах экосаэдра (включая Orthoreovirus, Aquareovirus, Cypovirus, Fijivirus, Oryzavirus и, как и большинство неклассифицированных вирусов беспозвоночных). Вторая группа включает роды, вирусы которых имеют ровные или почти сферические вирионы и кор без крупных поверхностных выступов по вершинам (Orbivirus, Rotavirus, Coltivirus, Phytoreovirus). Важно отметить, что номенклатура для описания вирусных частиц с различным числом интактных капсидных слоев варьирует у разных родов, хотя данная номенклатура может использоваться в любом случае. Транскрипционно активные коровые частицы вирусов, имеющих выступы, имеют только один полный капсидный слой (с симметрией Т=2), к которому прикрепляются выступы (спайки – spikes). У интактных вирусных частиц кор обычно окружен неполным протеиновым слоем (с симметрией Т=13), который перфорирован спайками, и образует внешнее капсидное покрытие. Поэтому, вирусные частицы обычно выглядят имеющими двухслойный чехол. Исключение составляют cypoviruses, имеющие вирион только с одной капсидной оболочкой, эквивалентной “коровой” частице вирусов других родов. У вирусов рода Сypovirus ранскрипционно активная частица с одной оболочкой является интактным вирионом, хотя характерным является то, что частицы некоторых cypoviruses могут смыкаться внутри матрикса протеиновых кристаллов, называемых полиэдрами (polyhedra), которые образованы более чем на 90% вирусным протеином – “полиэдрином”. В противоположность этому, вирусы с гладким кором содержат субкор, который может быть относительно хрупким, с полным протеиновым чехлом (Т=2), который усилен у транскрипционно активных коровых частиц полным слоем коровой оболочки (Т=13). Такие дважды покрытые коровые частицы, не имеют поверхностных выступов (спайков) и в интактном вирионе окружены внешним капсидным чехлом, приобретая вид частиц с тремя слоями оболочки. Самый внутренний протеиновый чехол вирусного капсида имеет диаметр 50-60 нм и окружает 10-12 геномных сегментов, представленных линейными двуспиральными РНК. Для вирусов с гладким кором характерно то, что энзиматически активные минорные протеины вириона также расположены внутри центрального пространства, и прикреплены к внутренней поверхности (с пятиосевым типом симметрии) (включая РНК-зависимую РНК полимеразу (транскриптазу и репликазу), NTPase, хеликазу, кэпирующие и трансметилазные энзимы). Для вирусов, имеющих кор с выступами, некоторые из протеинов-энзимов формируют “башенки” на поверхности кора. Выступы, имеющие внутри полость, используются как каналы для выхода образующихся мРНК, синтезируемых энзимами, связанными с кором.

Частицы вирусов, принадлежащих разным родам, могут покидать инфицированную клетку почкованием (Orbivirus) или почковаться внутрь эндоплазматического ретикулума (Rotavirus), приобретая мембранную оболочку, клеточного поисхождения, хотя во многих случаях оболочка сохраняется не долго. У вирусов некоторых родов протеины внешнего капсида могут быть модифицированы протеазами (такими как трипсин и химотрипсин), что приводит к образованию “инфекционных” или “промежуточных субвирусных частиц”. Такие изменения могут привести к изменению параметров частицы, определяющих прикрепление и проникновение в клетку.

Диаметр вириона 60-80 nm; Mr 120 x 10⁶; плавучая плотность в CsCl 1,36-1,39 г/см³.

Вирусные частицы умеренно резистентны к нагреванию, органическим растворителям (непример, эфиру) и неионным детергентам. Стабильность при различных значениях рН у представителей разных родов различна.

Геном. РНК: двуспиральная, линейная, сегментированная (10-12); 15-20% сухой массы вириона. Mr отдельных молекул РНК составляет 0,2-3,0 х10⁶, всей РНК – 12-20x10⁶. Вирион содержит позитивные и негативные цепи РНК в равных пропорциях – одна копия каждого сегмента на вирион. Интактные вирионы некоторых видов содержат также значительное количество коротких односпиральных РНК. Позитивные цепи каждого дуплекса кэпированы по 5’-концу (структура типа 1). Обе цепи РНК имеют 3’-ОН, и вирусные мРНК не имеют 3’-поли-А.

Другие компоненты вириона. Протеины составляют 80-85% сухого веса вириона. Размер протеинов варьирует по Mr от 15 до 155 х10³. Структурными компонентами вириона являются три мажерных капсидных протеина (СР) и некоторые из минорных протеинов. Не менее трех внутренних вирусных структурных протеинов составляют полимеразу и другие ассоциированные энзимы, участвующие в процессе синтеза мРНК и кэпировании (включая полностью консервативную dsRNA-зависимую ssРНК полимеразу (транскриптазу), нуклеотидфосфогидролазу, гуанилилтрансферазу, две трансметилазы и dsRNA-хеликазу).

Зрелый вирион не содержит липидной оболочки. В зависимости от рода миристиловые остатки могут быть ковалентно связаны с одним из вирусных протеинов. Для колти-, рота- и орбивирусов характерно приобретение липидной оболочки на промежуточной стадии морфогенеза или при выходе из клетки, которая впоследствии теряется.

У вирусов некоторых родов, один из поверхностных протеинов, а также мелкие неструктурные вирусные протеины могут быть гликозилированы.

Организация генома и репликация. Вирусные РНК в основном моноцистронные, хотя некоторые сегменты имеют второй функциональный инициирующий кодон или другие ORFs. Протеины кодируются только на одной цепи (мРНК) каждого дуплекса. Проникновение вируса в клетку различается у представителей разных родов, но обычно является результатом потери компонентов внешеного капсида. Транскрипционно-активные родительские вирусные частицы (коры) высвобождаются в цитоплазму клеток. Повторяющаяся асимметричная транскрипция полноразмерных мРНК каждого сегмента dsRNA (двуспиральной РНК) происходит внутри этих частиц. Продукты мРНК, образующиеся в большом количестве с меньших сегментов, выводятся через вершины икосаэдральной частицы. Структуры, обозначаемые вироплазмами или вирусными тельцами-включениями встречаются в отдельных областях цитоплазмы, являющихся местами репликации и сборки вновь образуемых вирусов. При электронно-микроскопическом исследовании вироплазмы выглядят гранулярными средней электроноплотности и могут содержать вновь образующиеся вирусные частицы. Компоненты внешнего капсида приобретаются на периферии вироплазм.

Механизм синтеза и ассемблирования генома изучен недостаточно. Относительно ортореовирусов показано, что кэпированные мРНК и определенные NS протеины инкорпорируются внутрь “комплекса”, считающегося предшественником будущих вирусных частиц. Затем мРНК используется в качестве матрицы для одного раунда синтеза негативной цепи, с образованием сегментов dsRNA. Разные мРНК находятся в цитоплазме в разных соотношениях. Однако dsRNA геномные сегменты обычно упаковываются в точном эквимолярном соотношении (одна копия каждого геномного сегмента в одной частице). Сегменты РНК имеют коныервативные терминальные последовательности по обоим концам, которые используются как сигналы распознавания для РНК транскриптазы или репликазы. Эти сиквенсы также могут иметь значение для селекции и инкорпорирования РНК внутрь новых частиц. Для одного рода описано, что РНК зрелых частиц упаковывается в виде серии концентрических и высокоорганизованных чехлов (shells), с элементами экосаэдральной симметрии.

Кроме родительских субвирусных частиц (коров), вновь образованные коры также синтезируют мРНК, обеспечивая этап амплификации и репликации. В зависимости от рода, некоторые протеины NS участвуют в транслокации вирусных частиц внутри клетки и их выходе.  Многие cypoviruses формируют также полиэдры, являющиеся крупными кристаллическими протеиновыми матрицами, включающими вирусные частицы, и участвующими в трансмиссии между отдельными насекомыми-хозяевами. Этапы морфогенеза и высвобождения вируса зависят от рода. Реассортация сегменов генома происходит легко в клетках, коинфицированных вирусами одного вида.

Антигенные свойства. Вирусы позвоночных имеют групповые или серогрупповые (видоспецифические) антигены, а внутри каждой серогруппы – более вариабельные серотип-специфические антигены. Вирусы насекомых и растений могут проявлять меньшую вариабельность по протеинам, вероятно из-за отсутствия антитело-опосредованного селективного прессинга. Между родами антигенного родства не установлено. Некоторые вирусы обладают гемагглютинирующими свойствами.

 Биологические особенности. Биологические особенности вирусов зависят от их родовой принадлежности. Некоторые вирусы репродуцируются только в определенных видах позвоночных и передаются между хозяевами алиментарно или аэрозольно. Другие вирусы позвоночных (орби- и колтивирусы) реплицируются как в позвоночных, так и в беспозвоночных (москиты, клещи, комары и др.). Вирусы растений реплицируются как в растениях, так и в членистоногих (векторах). Вирусы патогенные для насекомых (cypoviruses) передаются контактно или алиментарно.

Критерии подразделения на виды внутри семейства. Главным критерием для включения вирусного изолята в тот или иной вид внутри семейства является способность к реассортации сегментов генома во время коинфекции. Однако прямых свидетельств реассортации сегменов генома между разными вирусными штаммами недостаточно, поэтому для анализа родства, сходства и различий используются другие методы: идентификация естественных хозяев и векторов, клиническое проявление, серологические особенности, сравнительный анализ нуклеотидных и аминокислотных сиквенсов, перекрестная гибридизация РНК и кДНК, анализ консервативных областей генома, определение серотипа, определение электрофоретипа (анализ профиля миграции сегментов генома при электрофоретическом разделении), амплификация консервативных областей с использованием ПЦР (с последующим анализом продуктов в перекрестной гибридизации, рестрикционном анализе и секвенированием). Миграция dsRNA геномных сегментов при электрофрезе в полиакриламидном геле (PAGE) сильно зависит от первичной структуры и Mr молекул. Однако миграционные характеристики при электрофорезе в агарозном геле (AGE) зависят только от Mr. Поэтому последний вариант может быть более удобным для идентификации и дифференциации вирусных видов с использованием электрофоретипирования, тогда как PAGE более чувствителен и может быть ипользован для более тонкой дифференциации между штаммами внутри одного вида.

Род: Orthoreоvirus.

Типовой вид: Mammalian orthoreovirus (MRV) (ортореовирус млекопитающих).

Характерные особенности. Инфицируют только позвоночных, распространяются аэрозольным и алиментарным путями. Все члены рода имеют: 1) хорошо определяемую, при негативном контрастировании, капсидную структуру; 2) 10 сегментов dsRNA, представленных тремя крупными (L), тремя средними (М) и четырьмя мелкими  (S) сегментами; 3) характерный протеиновый профиль с тремя l, тремя m и четырьмя s первичными продуктами трансляции; 4) 1-2 дополнительных очень мелких протеинов, кодируемых полицистронным геномным сегментом; 5) все члены двух вторых подгрупп индуцируют образование синцития.

Характеристика вириона.

Морфология. Вирион икосаэдральной симметрии, но может выглядеть сферическим, имеет двойную протеиновую капсидную оболочку. Криоэлектронная микроскопия на примере MRV и ARV показала следующее строение вириона. Вирион состоит из центральной части (диаметр 48 нм), содержащей сегменты dsRNA, и внешнего капсида (диаметр 85 нм), имеющего икосаэдральную симметрию (Т=13). Поверхность вириона покрыта 600 пальцевидными выступами (отростками, длиной 10 нм), организованными в 60 гексамерных и 60 тетрамерных кластеров, которые окружают каналы (диаметром 5-8 нм), радиально проникающие через внешний капсидный слой и достигающие центральной полости. Интактные вирионы содержат большие открытые углубления, имеющие форму цветка (пятичленного), придающего капсиду при трехмерном анализе угловой профиль. Промежуточные субвирусные частицы (ISVP), образующиеся при частичном удалении внешних капсидных протеинов, имеют диаметр примерно 80 нм. Цветкообразные структуры могут включать увеличенную форму протеина s1, участвующего в прикреплении к клетке, расположенного по вершинам в виде спайка длиной 40 нм. Коровые частицы, образуемые при более значительном удалении внешних капсидных протеинов, имеют на своей поверхности 150 эллипсоидных узелков и своеобразных “башенок”, расположенных на пятиугольных вершинах. Mr (вириона) 130 x 10⁶, плавучая плотность в CsCl 1,36 г/см³ (1,38 г/см³ – для ISVPs, 1,43 г/см³ – для коровых частиц). S_20w  730S, 630S и 470S, для вириона, ISVP и коровых частиц, соответственно. Вирионы стабильны при сильных ионных воздействиях, температуре до 55 ^оС, значениях рН 2-9, возействии жирорастворителей и детергентов. УФ облучение снижает инфекционность.

Геном.. 10 сегментов линейных двуспиральных РНК, Mr 0,6-2,6 х10⁶. Общая Mr генома MRV-3 около 15х10⁶ (23549 bp); 11,5% сухой массы вириона. По  подвижности в геле сегменты были подразделены на три группы: L (L1-L3; 3,8-3,9 kbp), M (M1-M3; 2,2-2,3 kbp) и S (S1-S4; 0,9-1,6 kbp). Полная вирусная частица содержит многочисленные олигонуклеотиды (длиной 2-20 оснований), составляющих примерно 25% общего содержания РНК, три четверти которых представляют собой абортивные повторяющиеся 5’-концевые транскрипты, образованные кор-ассоциированными транскриптазой и кэпирующими ферментами, тогда как остальное составляют олигоаденилаты. Геномные РНК не имеют поли-А, и не содержат ковалентно связанных протеинов. Геномные сегменты dsRNA содержат 5’- и 3’-концевые последовательности по 4-5 bp, которые консервативны у всех 10 геномных сегментов у конкретного вирусного вида. 3’-концевой консенсунсный сиквенс (UCAUC-3’) также консервативен между тремя подгруппами ортореовирусов, как минимум, для четырех геномных сегментов класса S. 5’-концевой консервативный сиквенс различен.

Протеины. Структурные протеины ортореовирусов обозначаются в соответствии с их относительной массой и классом (l1, 2 и 3; m1 и 2; s1, 2 и 3 (для ARV эти протеины обозначаются, соответственно, lА, В и С; mА и В; sА, В и С) (смотри таблицу). Стабилизированная структура внешнего капсида состоит из 200 тримеров продуктов разрезания протеина m1 (Mr 76х10³, после разрезания – Mr 72х10³ и Mr 4х10³). Субъединицы m1 взаимодействуют с мономерами протеина s3, который образует выступы на поверхности вириона. Пентамерные субъединицы протеина l2 формируют цветкообразные структуры и “башенки” по вершинам вириона и кора. Структуры протеина l2 взаимодействуют с тетрамерными субъединицами протеина s3 и с протеином  m1С, составляя основу внешнего капсида. Протеин l2 связан с кором вириона. Четвертый компонент внешнего капсида протеин s1, представлен в виде 12 гомотримеров, связанных с вершинами вириона. Протеины l1 и s2 (по 120 копий каждый) представляют собой мажерные структурные протеины внутреннего капсида и взаимодействуют с геномом (обладают способностью связывать dsRNA (двуспиральные РНК). Два структурных протеина вируса l3 и m2 представлены в вирионе 12-ю копиями, расположенными внутри внутреннего капсида. Протеин l3 формирует отростки длиной 7 нм, простирающиеся по направлению внутренней части кора, и образующие нижележащий слой 12-ти вершин капсида. Протеин m2, вероятно, связан со структурами протеина l3.

Сегменты dsRNA, кодируемые протеины ортореовируса млек-щих 3-го серотипа (MRV-3).

Другие компоненты вириона. Зрелые вирионы не имеют липидной оболочки. Мажерный протеин внешнего капсида m1 и продукт его разрезания m1N меристилированы по N-концу. Вопрос о гликозилировании протеинов ортореовирусов окончательно не выяснен. Есть свидетельства, что все протеины MRV и ARV могут быть гликозилированы, за исключением мажерного протеина внутреннего капсида (s2 для MRV и s1 (sА) для ARV).

Организация генома и репликация. Геном представлен 10 сегментами dsRNA, упакованных в эквимолярном соотношении (одна копия сегмента на вирион). Сегменты содержат терминальные NTRs, которые короче по 5’-концам (соответственно 12-32 bp и 35-38 bp для MRV-3). Большинство сегментов имеют мажерную ORF (353-1298 кодонов). Один геномный сегмент полицистронный, содержит более одной функциональную ORF.

Полный процесс инфекции включает адсорбцию, проникновение и раздевание коровых частиц (зависящие от низких рН), асимметричную транскрипцию кэпированных неполиаденилированных мРНК (с использованием консервативных механизмов – новая цепь смещается), трансляцию, ассемблирование плюс-цепей внутрь новых субвирусных частиц, переход плюс-цепи в двуспиральную РНК и дальнейшие раунды транскрипции и трансляции мРНК. Финальная стадия репликативного цикла включает ассемблирование внешнего капсида и новых субвирусных частиц, с образованием инфекционных вирионов. Такие частицы скапливаются в виде паракристаллов в перинуклеарных участках ядерной цитоплазмы и высвобождаются после лизиса клетки. Подгруппы 2 и 3 (ARV, BRV и NBV) образуют мультиядерный синцитий (через 10-12 часов от начала инфекции).

Протеин MRV s1, участвующий в прикреплении к клетке, определяет клеточный и тканевой тропизм штаммов и обладает гемагглютинирующей активностью. Аналогичные протеины ARV и NBV s3, имеющие вид мультимерных суперскрученных доменов, сходны с таковыми MRV, но не обладают гемагглютинирующей активностью. Вирусы подгрупп птиц и бабуинов кодируют  протеин, связанный с образованием синцития.

Антигенные свойства. Серотип-специфическим антигеном ортореовирусов, взаимодействующим с нейтрализующими антителами является протеин s1 (s3/sС - у птичьих видов). На основе этих антигенов различают 3 серотипа MRV и 5-11 серотипов ARV. Протеины MRV s1 и s1s проявлют штаммовую специфичность и перекрестную цитотоксическую Т-клеточную активность. Протеины MRV l2 и s3 являются группоспецифическими антигенами, аналогичными протеинам ARV l2/lВ и s2/sВ. Гомология по сиквенсу отмечается только между штаммами внутри вида. Наиболее сильное антигенное сходство показано в отношении ARV и NBV.

Биологические особенности. Распространяются алиментарно и аэрозольно; членистоногих переносчиков нет. Отмечается специфичность по отношению к естественным хозяевам (бабуины, летучие мыши, птицы, КРС, человек, обезьяны, овцы, свиньи, змеи). Распространены повсеместно. Ортореовирусы человека, как правило, авирулентны, но могут вызывать заболевания верхних дыхательных путей и энтериты у детей. У мышей ортореовирусные инфекции сопровождаются диареей, замедлением развития, синдромом жирных волос, гепатитами, желтухами, миокардитами, миозитами, пневмониями, энцефалитами и неврологическими симптомами. У домашних животных инфекция сопровождается поражением дыхательных путей и диареями. У обезьян инфекция проявляется развитием гепатита, билиарной атрезии, менингитов, некрозов эпендимы и эпителиальных клеток хороидального сплетения. Изолят BRV был выделен от бабуинов с менингэнцефаломиелитом, а изоляты от змей – от животных с признаками неврологических расстройств. Птичьи ортореовирусы не инфицируют млекопитающих. Исход болезни у птиц варьирует от инаппарантной формы, до летального, что зависит от штамма вируса и возраста птицы. При развитии системной инфекции вирус выделяется из многих тканей. У цыплят болезнь проявляется нарушением оперения, гастроэнтеритами, гепатитами, миокардитами, пневмониями, потерей веса, слабым ростом, гибелью. У индеек ортореовирусная инфекция проявляется в виде энтеритов. У птиц, перенесших острую системную инфекцию, развивается теносиновит, напоминающий патологию ревматоидного артрита у людей.

Критерии подразделения на виды внутри рода. Ортореовирусы включают 4 вида и 2 неклассифицированных вируса. Определяющим критерием для классификации по видам является прямое доказательство обмена генетическим материалом путем реассортации сегментов генома. На данный момент нет сведений о реассортации между четырьмя видами. Представители данного рода могут быть идентифицированы по следующим признакам:

1) Способность к обмену генетическим материалом путем реассортации сегментов генома во время коинфекции, продуцируя жизнеспособные вирионы.

2) Идентификация консервативных терминальных сиквенсов геномных РНК внутри вида (абсолютная консервативность 4-8 bp 5’- и 3’-концов).

3) Идентификация идентичности сиквенсов между протеинами, кодируемыми гомологичными геномными сегментами (более 85% идентичности по аминокислотам внтури вида и 65% - между видами).

4) Идентификация идентичности сиквенсов между гомологичными сегментами генома (более 75% идентичности по внтури вида и 60% - между видами).

5) Идентификация серотипа вируса (на основе перекрестной нейтрализации) с вирусным типом, уже классифицированным в качестве вида данного рода.

6) Демонстрация широкого антигенного сходства по мажерным структурным протеинам внутри вида, с использованием ELISA и иммунопреципитации.

7) Анализ электрофоретипа с помощью AGE, но не PAGE

8) Сходная организация полицистронных геномных сегментов.

9) Идентификация хозяина и клинические признаки.

На основе анализа аминокислотных сиквенсов протеина s2 (мажерный, внутреннего капсида) 4 вида ортореовирусов можно подразделить на 3 подгруппы. Подгруппа 1 включает все нефузогенные изоляты MRV, представленные одним видом MRV и подразделяемые на серотипы. Подгруппу 2 составляют два вида, представленных многочисленными изолятами ARV, выделенными от промышленной птицы (включая несколько серотипов), и NBV (выделенным только однажды от летучих лис). Аминокислотная идентичность по протеину класса S между этими двумя видами составляет 40-60%, идентичность по гомологичным протеинам между подгруппами составляет 20-30%, между изолятами внутри вида – 90%. Два данных вида, образующих синцитий, более близки в антигенном отношении между собой, чем по отношению к другим видам, обладают сходным консервативным концевым сиквенсом сегментов генома и проявляют сходство в организации полицистронного, индуцирующего слияние (fusion-inducing), геномного сегмента S1. По сиквенсной дивергенции и неспособности к реассортации изоляты ARV и NBV подразделяются в отдельные виды в пределах одной подгруппы. Третья подгруппа представлена одним видом BRV. Этот изолят также вызывает образование синцития, но имеет небольшое сходство по сиквенсу (20-30%) и антигенным свойствам с другими фузогенными видами. BRVтакже содержит полицистронный геномный сегмент S4, эквивалентный сегменту S1, с отличающейся организацией гена, протеин слияния, не имеющий сходства с аналогом ARV и NBV, и уникальный консенсунсный сиквенс по 5’-концу.

Два неклассифицированных вируса, выделенных от змей, также способные индуцировать слияние клеток, но не имеющие электрофоретического профиля геномного сегмента, сходного с таковым у ARV и BRV. Ndelle virus (NDEV) ранее обозначался как неклассифицированный орбивирус, однако анализ генома показал высокую степень гомологии с MRV, как минимум, по четырем геномным сегментам.

Виды (4 вида):

Предполагаемые виды (3):

Python orthoreovirus (PRV), Rattlesnake orthoreovirus (RRV), Ndelle virus (rodents) (NDEV).

Род: Orbivirus. Типовой вид: Bluetongue virus (BTV) (вирус блютанга).

         Характерные особенности. Вирион имеет капсид без особых характерных признаков. Геном представлен 10 сегментами двуспиральной РНК. Коровые частицы имеют характерные кольцевидные капсомеры. Репликация сопровождается продукцией вирусных “трубочек” (tubules) и вирусных телец-включений; мажерный внешний коровый протеин (VP7(T13)) может формировать в цитоплазме клеток плавучие гексагональные кристаллы. Распространение вируса происходит с участием кровососущих членистоногих.

Характеристика вириона.

Морфология. Вирион BTV икосаэдральной симметрии, но может выглядеть сферическим; диаметр 80 нм; коровые частицы имеют максимальный диаметр 73 нм, субкор имеет максимальный диаметр 59 нм и внутренний диаметр 46 нм. Зрелый вирион не имеет липидной оболочки. Выход из клетки осуществляется через плазматическую мембрану, при этом может формироваться липидная оболочка, которая вскоре теряется. Неочищенные вирионы часто ассоциируются с клеточными мембранами. При обычной электронной микроскопии поверхность вириона неразличима, однако внешний капсид имеет определенную структуру икосаэдральной симметрии и парусообразные (“sail”-shaped) поверхностные выступы, которые могут быть обнаружены на вирионе, сохранившем структуру (например, при использовании криоэлектронной микроскопии). При удалении внешнего капсидного слоя можно различить поверхностный слой коровой частицы, который полностью состоит из капсомеров VP7(T13), организованных в виде гексамерных колец (пентамерных – по пятигранным вершинам). Эти кольца, легко различимые с использованием обычной электронной микроскопии, и послужили основой для названия рода. Коровые частицы также содержат полный внутренний капсидный чехол (подкоровый слой), который окружает 10 геномных сегментов dsRNA. Минорные коровые протеины (транскриптазный комплекс) прикреплены к внутренней поверхности субкора по пятиосной симметрии. Сборка субкорового слоя определяет конечный размер и симметрию частицы. Mr (вирион) 108 x 10⁶, Mr (кор) 67 x 10⁶; плавучая плотность в CsCl 1,36 г/см³ и 1,40 г/см³ (для вириона и кора, соответственно); S_20w  550S, 630S и 470S (для вириона, и коровых частиц, соответственно). Инфекционность вирионов стабильна при рН 8-9, но резко снижается при значениях рН, выходящих за рамки 6,5-10,2. Чувствительность внешних капсидных протеинов к воздействию катионов (например, MgCl₂, CsCl) зависит от рН среды и штамма. При рН ниже 5,0 вирионы и коры разрушаются. За исключением ортореовирусов, при рН 3,0 инфекционность вируса утрачивается. В пробах крови, сыворотки или альбумина, при температуре не выше 15 ^оС, вирус может сохраняться в течение десятилетий. Очищенные вирионы BTV в 0,1 М Тris/HCl рН 8, при температуре 4 ^оС сохраняют активность в течение года. Кристаллы коровых частиц очень стабильны при температуре 29 ^оС. При нагревании до 60 ^оС инфекционная активность вируса резко падает. В целом орбивирусы относительно резистентны к воздействию растворителей и детергентов, хотя к отдельным детергентам чувствительность отдельных вирусов может различаться. Додецилсульфат натрия разрушает частицы. Замораживание приводит к снижению инфекционности вируса на 90%, за счет разрушения частиц. При однократном замораживании и хранении при минус 70 ^оС инфекционность вируса сохраняется.

Геном.. 10 сегментов линейных двуспиральных РНК, имеющих Mr 0,6-2,6 х106. Общая Mr генома MRV-3 около 15х10⁶ (23549 bp); 12% и 19,5% сухой массы вириона и кора, соответственно. Геномная РНК упаковывается в виде серий упорядоченных концентрических чехлов внутри VP3(Т2) слоя субкора. Четыре слоя РНК, каждый из которых имеет элементы икосаэдральной симметрии, может быть выявлен в коре BTV методом кристаллографии (рентгеновскими лучами). Внутри центрального пространства субкора молекулы dsRNA ассоциируются с плотной белковой субстанцией по вершинам пятиосной симметрии (вершинам икосаэдрона). Геномная РНК содержит 5’-концевую структуру Cap 1 (7mGpppG^(2-Om)). Размер сегментов генома вируса блютанга варьирует от 822 до 3954 bp (общий размер 19,2 kbp, общая Mr 13,1 х 10⁶). Короткие олигонуклеотиды внутри зрелых вирионов не обнаружены. Геномные РНК обозначаются сегментами 1-10 в соответствии с повышением электрофоретической подвижности в 1% агарозном геле и в соответствии со снижением молекулярного веса. Например, для вируса блютанга сегменты подразделены по подвижности на три класса: 3 крупных (1-3; 3,9-2,8 kbp), 3 средних (4-6; 2,0-1,6 kbp) и 4 малых сегмента (6-10; 1,2-0,8 kbp). В сегментах генома, проанализированных на данный момент, выявлены только по одной ORF, которые всегда на одной и той же цепи.

Для BTV-10 5’-NTR варьирует от 8 до 34 bp, тогда как по 3’-концу они составляют 31-116 bp. У других вирусов данная область также короче по 5’-концу, относительно 3’-конца. У BTV NTRs включают терминальные последовательности в 6 bp, которые идентичны у всех 10 сегментов РНК, и которые консервативны у разных изолятов BTV. Другие орбивирусы имеют похожие сиквенсы, но которые не всегда идентичны и не всегда консервативны для всех 10 сегментов.

Другие компоненты вириона.Определено 7 вирусных структурных протеинов (VP1-7), составляющие 88% и 80,5% сухого веса вириона и кора, соответственно.

     Сегменты dsRNA и кодируемые ими протеины  вируса блютанга 10-го серотипа (BTV-10)

Протеины VP5 вируса BTV и, синтезируемые в клетках млекопитающих NS3/NS3a, могут быть гликозилированными.

У BTV внешний капсидный протеин (Mr 111х10³) представлен 180 копиями; парусообразный протеин VP2, представленный 360 копиями расположен ниже протеина VP5 (Mr 59х10³), который организован в 120 тримеров. VP2 и VP5 соприкосаются с VP7 (Т=13). Поверхность коровой частицы образована 780 копиями протеина VP7, которые организованы в сеть гекса- и пентамерных колец. Ниже расположен субкоровый капсидный чехол, образованный 120 копиями протеина VP3, организованного по Т=2 симметрии. VP3 (Т2) капсидный чехол окружает 10 двуспиральных сегментов генома и три структурных минорных протеина (VP1 (Pol, Mr 150х10³), являющийся РНК полимеразой; VP4 (Сар, Mr 76х10³), образующий функциональные димеры, обладающие активностью гуанилилтрансферазы и трансметилазы 1 и трансметилазы 2); и VP6/VP6a (Hel, Mr 36х10³), связывающий РНК и обладающий NTPaзной и хеликазной активностью).

Различают 3 неструктурных протеина. Протеин NS1 (TuP, Mr 64х10³) образует в клетках трубочки разлиной длины (до 4 мкм), функция которых не ясна, но которые являются характерными при орбивирусных инфекциях. Протеин NS2 (ViP, Mr 41х10³) является компонентом матрикса сборки и репликации. Протеины NS3/NS3а (Mr 25х10³ и 24х10³) участвуют в высвобождении вирусных частиц из клетки.

Организация генома и репликация. Сегменты генома BTV, в соответствии спрофилем миграции в 1%-ной агарозе, обозначаются следующим образом: Сегмент 1-VP1 (Pol); Сегмент 2-VP1; Сегмент 3-VP3 (Т2); Сегмент 4-VP4 (Сар); Сегмент 5-NS1 (TuP); Сегмент 6-VP5; Сегмент 7-VP7 (T13); Сегмент 8-NS2 (ViP); Сегмент 9-VP6/VP6a (Hel); Сегмент 10-NS3/NS3a. Родственные гены разных штаммов BTV сходны.

Для адсорбции вируса используются компоненты внешнего капсида, хотя для проникновения в клетку может быть использован VP7(Т13). VP2 (вероятно также и VP5) является определяющим вирулентность. Внешний капсидный слой теряется во время ранних стадий репликации. Транскрипционная частота мРНК отдельных геномных сегментов различна; с меньших сегментов синтезируется больше копий. Вирусные тельца-включения считаются местом морфогенеза транскрипционно активных вирусных коров, содержащих dsRNA. Наименьшие частицы, содержащие РНК, обнаруживаемые в тельцах-включениях, представляют собой вновь образованные субкоровые частицы. Внешний коровый протеин VP7(T13) добавляется в тельца-включения и внешний капсидный протеин. Вирусные частицы транспортируются внутри клетки благодаря специфическому взаимодействию с клеточным цитоскелетом, и могут покидать клетку до ее лизиса за счет взаимодействия с мембранно-связанным протеином NS3. Отмечена специфическая ассоциация между трубочками, образованными протеином NS1, и зрелыми вирионами в цитоплазме клетки. В клетках млекопитающих, репликация орбивирусов приводит к выключению синтеза белков клетки и обычно заканчивается лизисом клетки и высвобождением вирусных частиц. У персистентно инфицированных клеток насекомых, не наблюдается отключения синтеза клеточных белков, лизиса или ЦПЭ. У некоторых видов вирусов (AHSV) протеин NS3 определяет вирулентность. Вирусные частицы могут покидать клетку по двум основным путям: экструзией (разрушение мембрны клетки) и почкованием. В клетках Culicoides variipennis (вектора BTV) отмечается только почкование вируса, приводящее к появлению у вирионов мембранной оболочки, которая, однако, нестабильна и быстро теряется. Непрерывное высвобождение вирусных частиц из клеток и реинфекция явялются характерным признаком орбивирусной репликации.

Антигенные свойства. Основным вирусным серогрупповым (видоспецифичным) антигеном является иммунодоминантный внешний коровый протеин VP7(13). Антитела к данному белку обладают нейтрализующей активностью по отношению к коровым частицам, но не для интактного вириона. Другие вирусные протеины также консервативны между видами вирусов (особенно кор и неструктурные протеины). Однако некотрые белки могут проявлять перекрестную активность с аналогичными белками вирусов других видов (чаще односторонне). Анализ сиквенса РНК консервативных сегментов показал возможность подразделения всех орбивирусов на 4 основные “группы”. Первая граппа (А) включает AHSV, BTV, EHDV, EEV, EUBV, PALV, WALV и WARV. Вторая группа (В) включает CNUV, IERIV, WMV и GIV. Третья группа (С) включает CORV. Четвертая группа (D) включает WGRV. Все виды орбивирусов включают несколько серотипов, которые могут быть идентифицированы в реакции нейтрализации интактных вирусных частиц (в первую очередь, через взаимодействие антител с внешними капсидными протеинами). Главным антигеном BTV, участвующим в нейтрализации, является протеин VP2. Протеин VP5 также может быть использован в определении серотипа вируса, вероятно за счет конформационного скрытия протеина VP2. Оба эти протеина (VP2 и VP5) BTV проявляют очень высокую степень антегенной и сиквенсной вариабельности. У других вирусов (GIV) относительный размер внешних капсидных протеинов (VP4 и VP5) очень различен и их роль также может быть различной. Очевидно, что VP2 BTV (особенно в ассоциации с VP5) и VP7(T13) могут быть протективными антигенами.

У AHSV мелкие неструктурные протеины NS3 и NS3 также вариабельны и на основе анализа сиквенсов могут быть подразделены на три группы (a, b и g). Предварительные данные свидетельствуют о слабой перекрестной активности NS3 между этими группами. Данный белок может участвовать в определении вирулентности (AHSV), вероятно в результате своего участия в высвобождении вирусных частиц из клетки (почкование) и последующего дессиминирования вируса.

Биологические особенности. Инфекционность коровых частиц BTV может быть в 1000 раз ниже, чем у интактных вирусных частиц, или совсем отсутствовать, в зависимости от используемой культуры клеток млекопитающих. Однако в некоторых клетках насекомых и взрослых насекомых-векторах инфекционность коровых частиц лишь немного ниже, чем у интактных вирионов. Обработка вирионов трипсином или химотрипсином приводит к образованию инфекционных субвирусных частиц. Такие субвирусные частицы BTV теряют гемагглютинирующую активность, так же как и склонность к аггрегированию, но значительно повышают инфекционность по отношению к взрослым насекомым-векторам и некоторым культурам клеток насекомых.

Орбивирусы инфицируют широкий спектр позвоночных, включая жвачных (домашних и диких), однокопытных (домашних и диких), грызунов, птиц, сумчатых, летучих мышей, ленивцев, приматов, и человека. Орбивирусы репродуцируются в членистоногих, которые являются основным фактором их распространения (комары, москиты, флеботомусы, клещи, в зависимости от вида вируса). Показана трансстадийная передача у клещей. Может происходить внутриутробное заражение у позвоночных. Орбивирусы, переносчиками которых являются членистоногие с коротким жизненным циклом (комары, москиты, мошки), энзоотичны только в районах, где имаго векторов может существовать большую часть года. Нет сведений о трансовариальной передаче орбивирусов у Culicoides, хотя они выделялись из культур клеток, приготовленных из яиц клещей. BTV и EHDV распространены повсеместно между параллелью 50^о северной широты и параллелью 30^о южной широты в Америке и между 40^о северной широты и параллелью 35^о южной широты – в остальном мире. Однако очевидно, что вирус персистирует в зимний период без признаков болезни у хозяев. Механизм персистенции у видов позвоночных (естественных хозяев) даже на низком уровне может иметь очень важное значение. Распространение вирусов также зависит от первичного заноса в районы, где имеются восприимчивые позвоночные и подходящие виды переносчиков. По этой причине, не все серотипы каждого вида (например, BTV) присутствуют в данной местности, где некоторые серотипы эндемичны. Инфекция орбивирусов у членистоногих не проявляется или проявляется очень незаметно. Инфекция у позвоночных может варьировать от инаппарантной до фатальной, в зависимости от вида вируса и животного-хозяина. Некоторые штаммы BTV вызывают гибель овец, другие – различную патологию, включая геморрагии, хромоту, отеки живота, кратковременный цианоз языка (что дало название вирусу), поражения носа и рта и т.п., тогда как другие не вызывают явной патологии. Инфекция, вызванная BTV, у КРС может не проявляться клинически, но сопровождается длительным вирусоносительством. AHSV, EHDV, EEV могут вызывать серьезную патологию у соответствующих естественных хозяев (позвоночных). Уровень смертности в серологически чистой популяции может превышать 98% (AHSV).

Критерии подразделения на виды внутри рода. Также как и в отношении представителей других родов семейства, определяющим критерием для классификации по видам является доказательство способности к реассортации генетических сегментов при коинфекции, с образованием жизнеспособного потомства. Однако на данный момент недостаточно сведений о реассортации между изолятами, и в основе методов диагностики отдельных видов  (серогрупп) лежат серологические исследования (с использованием иммунодоминантного серогруппового (видоспецифичного) антигена VP7(Т13)).

Представители данного рода могут быть идентифицированы по следующим признакам.

1) Способность к обмену генетическим материалом путем реассортации сегментов генома во время коинфекции, приводящим к образованию жизнеспособных вирионов.

2) Высокий уровень серологического перекрестного реагирования в ELISA, или таких методиках, как реакция связывания комплемента, реакция диффузной преципитации (иммунодиффузии в геле), с использованием поли- или моноклональных антител, специфичных консервативным антигенам, таким как VP7(Т13). Например в конкурентном ELISA, при разведении тестируемых сывороток 1:5, позитивные сыворотки проявляют 50%-ю ингибицию цветной реакции, тогда как негативные контрольные сыворотки или сывортки, специфичные другому виду будут проявлять ингибицию менее 25% в сравнении с контролем. Разные, но родственные виды могут проявлять слабую перекрестную реактивность, которая может быть только односторонней.

3) Высокий уровень сходства сиквенсов РНК консервативных геномных сегментов. Вирусы внутри одного вида проявляют обычно менее 24% вариабельности по сиквенсу в геномном сегменте 3 (кодирующем мажерный субкоровый структурный протеин VP3(T2)). Вирусы разных видов обычно вариабельны более, чем на 26% по сиквенсу данного участка (смотри пункт 9). Эти различия также отражают амнокислотные сиквенсы вирусных протеинов.

4) Относительно эффективная перекрестная гибридизация консервативных геномных сегментов (которые не кодируют внешние капсидные компоненты, или другие вариабельные протеины) при строгих условиях (более 85% гомологии) (Northern или dot blot, с зондами, специфичными вирусной РНК или кДНК).

5) ПЦР с использованием праймеров к консервативным участкам генома или сегментам, таким как сегменты 3 и 7. Может сочетаться с анализом перекрестной гибридизации (Northern или dot blot).

6) Идентификация по серотипу вируса с вирусным типом, уже классифицированным в качестве вида данного рода. Серотипы разных видов не спосбны к перекрестной нейтрализации.

7) Анализ электрофоретипа с помощью AGE, но не PAGE. Вирусы, относящиеся к одному виду проявляют относительно одинаковый электрофоретип. Однако крупные делеции/вставки могут приводить к проявлению разного профиля электрофоретипа у членов одного вида (например, у EHDV) и некоторое сходство может быть между близкородственными видами.

8) Идентичные консервативные терминальные участки геномных сегментов (некоторые близкородственные виды могут иметь идентичные терминальне сиквенсы по нескольким сегментам).

9) Идентификация общего вектора (переносчика) или вида-хозяина и клинических признаков. Например, BTV переносится только видами Culicoides и может инфицировать овец и КРС, с проявлением сильно различающихся клинических признаков, но не инфицирует лошадей. В отношении AHSV все наоборот.

Названия членистоногих переносчиков и название хозяина показаны в  скобках {}.

Виды (19 видов):

Предполагаемые виды (13):

Род: Rotavirus. Типовой вид: Rotavirus A (RV-1) (ротавирус А).

             Характерные особенности.  Вирусные частицы, наблюдаемые при электронной микроскопии с использованием негативного контрастирования, имеют вид колеса, откуда и происходит название рода. Трехслойный капсид окружает геном, состоящий из 11 сегментов двуспиральной РНК, и имеет уникальный путь морфогенеза, в котором присутствует этап кратковременного наличия липидной оболочки, появляющейся при почковании незрелых частиц в эндоплазматический ретикулум. Вирусы инфицируют только позвоночных и распространяются алиментарно.

Характеристика вириона.

Морфология. Данные, полученные по ротавирусу обезьян А (simian rotavirus A/SA11 (SiRV-A/SA11)) представляют собой парадигму, по отношению к другим вирусам рода. Зрелый инфекционный вирион имеет внешний диаметр примерно 100 нм и обладает тремя концентрическими протеиновыми слоями без липидосодержащей оболочки. Внутренний слой, представленный белком VP2, имеет диаметр 51 нм и толщину 3,5 нм. Этот слой сравним с внутренним капсидным слоем вирусов некоторых других родов данного семейства (например, VP3(Т2) слой вируса блютанга, который называется у орбивирусов субкором). Слой VP2 окружает вирусный геном и два структурных протеина VP1(Pol) и VP3(Cap), которые организованы в серии 12 энзиматических комплексов, прикрепленные к внутренней поверхности VP2(T2) по пятиосной симметрии. Собранная геномная РНК вместе с энзиматическими комплексами имеют общий диаметр примерно 44 нм и обозначаются как субкор ротавирусов. Однако этот субкор не эквивалентен субкору вирусов других родов (орбивирусов). Два внешних слоя интакной частицы ротавируса имеют решетчатую структуру поверхности (Т13) (levo), икосаэдральную симметрию и уникальный характерный набор из 132 крупных каналов, проходящих через оба слоя, и соединяющих внешнюю поверхность с самым внутренним протеиновым слоем VP2. Средний капсидный слой состоит из 780 копий протеина VP6(Т13), организованных в 260 тримерных морфологических единиц, располагающиеся трехосно по икосаэдральной решетке. Этот слой образует внешнюю поверхность “двухслойной” частицы (диаметр примерно 70,5 нм) и сравним с одним из капсидных слоев вирусов некоторых других родов внутри данного семейства. Например, коровые частицы орбивирусов имеют внешний коровый слой из 780 копий протеина VP7(Т13), который структурно сходен с протеином VP6(Т13) ротавирусов. Самый внешний слой ротавирусного капсида, состоящий из двух протеинов (VP4 и VP7), и необходимый для сохранения инфекционности, имеет приблизительный диаметр 75 нм. Гликопротеин VP7 образует поверхность внешней оболочки и организован в виде тримеров, взаимодействующих с концами тримеров, образованных протеином VP6(T13). Протеин VP4 образует 60 димерных выступов (спаек) длиной примерно 20 нм, которые простираются от поверхности внешней оболочки примерно на 12 нм, давая максимальный диаметр 100 нм. Эти спайки проходят внутрь частицы и могут взаимодействовать с VP7 и VP6, и даже VP2(Т2). Полноценная трехслойная частица ротавирусов имеет плавучую плотность в CsCl 1,36 г/см³ и S₂₀ 520-530S (в сахарозе). Инфекционность вируса исключительно зависит от наличия внешнего белкового слоя, целостность чего требует наличия кальция. Этот слой может быть удален при обработке вириона кальций-хелатными агентами (EGTA, EDTA). Инфекционность сохраняется при рН 3-9 (при стабилизации 1,5 мМ CaCl₂, практически не снижается при хранении при 4 ^оС или минус 20 ^оС в течение месяцев. Инфекционность относительно стабильна при нагревании до 50 ^оС, но резко снижается при серии замораживаний-оттаиваний. Инфекционность сохраняется при флюорокарбонной экстракции, обработке растворителями (хлороформ), или неионными детергентами (дезоксихолат натрия). Однако инфекционность теряется при обработке додецилсульфатом натрия (0,1%) или дезинфектантами (бетапропиолактон, хлорсодержащие агенты, формалин, фенол с 95% этанолом) которые удаляют внешний чехол. Гемагглютинирующая активность интактных частиц резко падает при 45 ^оС, в результате замораживания-оттаивания или в результате удаления спайков VP4 при рН 10. У разных штаммов ротавирусов могут быть вариации по физико-химическим характеристикам и стабильности. Например ротавирус человека не проявляет гемагглютинирующей активности и теряет протеины внешнего слоя гораздо легче, чем другие штаммы. В исследованиях по реассортации было показано, что это может быть связано с происхождением VP4. Двухслойные частицы неинфекционны, имеют плавучую плотность в CsCl 1,38 г/см³ и S₂₀ 380-400S (в сахарозе). Однослойные частицы могут быть получены при обработке двухоболочечных частиц хаотропными агентами (тиоционат натрия) или высокими концентрациями CaCl₂. Однослойные частицы имеют плавучую плотность в CsCl 1,44 г/см³ и S₂₀ 280S (в сахарозе).

Геном. Геном Rotavirus A (RV-A) окружен внутренним белковым чехлом. В каждой частице геном представлен одной копией dsRNA каждого из 11 сегментов, которые варьируют по размеру (изоляты RV-A) от 3302 bp до 663 bp и имеют общую длину примерно 18550 bp. Штаммы RV-A при фракционировании PAGE обычно имеют профиль сегментов 4:2:3:2. Сегменты генома нумеруются с 1 по 11 в соответствии с мобильностью в PAGE. Однако даже у RV-A мобильность сцепленных сегментов (чаще 7-9) может различаться. У других ротавирусов отклонения от соотношения профиля мобильности могут быть связаны с наличием дополнительного сегмента (1800 bp), включенного в вирион, в виде частично дуплецированных геномных сегментов. РНК генома имеет богатый A+U состав (58-67%). Сегменты полностью спарены, и позитивная цепь содержит 5’-концевую кэповую структуру, но не имеет сигнала полиаденилирования по 3’-концу. По сравнению с ортореовирусами, вирионы ротавирусов не содержат одноцепочечных олигонуклеотидов. Выявлено два уровня консервативности концевых сиквенсов у изолятов RV-A. Первый – все геномные сегменты имеют короткие консервативные 5’- и 3’-концы (10 и 8 нуклеотидов, соответственно). Непосредственно после этих участков по направлению внутрь цепей расположен второй консервативный регион (30-40 нуклеотидов), который специфичен для конкретного сегмента генома. Длина 5’-NTR различается, но все меньше 50 нуклеотидов и во всех сегментах предшествуют, как минимум, одной ORF, после первых AUG. Некоторые сегменты содержат дополнительные ORFs внутри рамки (гены 7, 9, 10) или вторую ORF (ген 11), но только в случае генов 9 и 11 они дают более, чем один первичный продукт трансляции (т.е. моноцистронные) с каждого геномного сегмента. Длина 3’-NTR варьирует от 17 нуклеотидов (сегиент 1) до 182 (сегмент 10), и в последнем случае, составляет около 25% общей длины сегмента.

Другие компоненты вириона. В отношении вируса RV-A определено 13 первичных продуктов трансляции. В случае гена 9 используются два инициирующих кодона в одной ORF, давая перекрывающиеся формы VP7. Ген 11 имеет две ORFs, которые кодируют VP5 и VP6. Номенклатура протеинов ротавирусов основана на профиле их миграции в SDS-PAGE, и начинается с наименее подвижного (с наибольшей Mr), с префиксом VP – для структурных протеинов, и NSP – для неструктурных. Определено 6 струкутрных протеинов. Вирусный кор состоит из геномных РНК, ассоциированных с VP1(Pol) и VP3(Cap), а VP2(T2) образует чехол кора (внутренний протеиновый слой капсида). Считается, что самый крупный протеин VP1(Pol) (Mr 125х10³) обладает активностью РНК-зависимой РНК полимеразы. Протеин VP3(Cap) (88х10³) обладает гуанилилтрансферазной активностью. Количество этих белков незначительно – не более 25 молекул на одну вирусную частицу. Протеин VP2(T2) (94х10³) представлен 120 копиями. Анализ аминокислотного сиквенса данного протеина показал наличие двух мотивов лейцинового зиппера (leucine zipper motif), которые считаются характерными для димеризации нуклеиновых кислот и связывающих протеинов. Средний протеиновый чехол вириона образован 780 молекулами протеина VP6(T13) (Mr 41х10³), организованных в 260 тримерных единицы. Два других протеина вириона VP4 (Mr 88х10³) и VP7 (Mr 38х10³), представленных в количестве 120 и 780 молекул, соответственно, образуют внешний чехол. Спайковый протеин VP4 (размером в 776 или 775 у большинсва штаммов, выделенных от человека) содержит сайт трипсинового разрезания. Разрезание дает in vitro два продукта VP5 (Mr 60х10³) и VP8 (Mr 28х10³), повышает инфекционность вируса.

Вирусным геномом кодирует 6 неструктурных протеинов. Наиболее крупный NSP1 (Mr 53х10³) является наиболее вариабельным протеином ротавирусов внутри конкретного вида (65% дивергенции по сиквенсу между штаммами RV-A). Более низкая вариабельность внутри вирусного вида показана для протеинов VP2(T2) – менее 25% и для VP4 – менее 45%. Однако на межвидовом уровне вариабельность этих белков значительна (более 87% для VP4, и более 84% – для VP2). Несмотря на вариабельность, протеин NSP1 имеет консервативный богатый цистеином мотив близ N-конца, который напоминает “цинковый палец” – металло-связывающий домен. Такой домен присутствует у ряда протеинов, связывающих нуклеиновые кислоты, и NSP1 связывает как цинк, так и ssРНК. Данный протеин участвует на ранних стадиях сборки вириона. NSP2(ViP) (Mr 35х10³) участвует в репликации РНК (особенно на ранних стадиях), и обладает неспецифической активностью связывания одно- и двуспиральных РНК. NSP3 (Mr 34х10³) также участвует в ранних стадиях репликации вирусного морфогенеза и выключении синтеза клеточных белков. Он образует мультимеры и обладает активностью связывания односпиральных РНК, специфичной для консервативных областей по 3’-концам вирусных мРНК. Протеин NSP4 (Mr 20х10³ и 28х10³) участвует в поздних стадиях созревания вириона и показано, что он может фукционировать как энтеротоксин. Протеин NSP5 (Mr 26х10³) обладает РНК-связывающей активностью, функция его не ясна. ORF протеина NSP6 (Mr 12х10³) консервативна у большинства исследованных вирусных изолятов, функция белка не ясна.

                   Сегменты dsRNA и кодируемые ими протеины  ротавируса A/SA11.

Примечание: * - в скобках указано количество аминокислот.

О наличии в составе вирионов липидов сообщений нет, хотя незрелые частицы, при почковании в эндоплазматический ретикулум могут временно иметь мембрану. Три вирусных протеина гликозилированы.

Организация генома и репликация. Цикл репликации, продолжающийся 10-12 ч при 37 ^оС был изучен на перевиваемой культуре клеток почки обезьян. Определено, что вирусный протеин VP4 участвует в прикреплении к клетке, однако соответствующий клеточный рецептор не идентифицирован. Вирус может проникать в клетку двумя путями: рецептор-опосредованным эндоцитозом и прямым проникновением. В обоих случаях удаляется внешний белковый чехол и в цитоплазму высвобождается транскрипционно активная двухоболочечная частица. Вирион-ассоциированные энзимы продуцируют 5’-кэпированные неполиаденилированные мРНК, являющиеся полноразмерными транскриптами минус-цепей каждого геномного сегмента, и несущие две функции: транслируются в вирусные протеины или являются матрицами для репликации генома. Ассемблирование 11 мРНК предшествует синтезу негативных цепей. После связывания с VP6, незрелая вирусная частица, почкуясь в эндоплазматический ретикулум, приобретает липидную мембрану, которая теряется при последующем присоединении VP4 и VP7.

Антигенные свойства. Для детальных антигенных характеристик проводят анализ трех вирусных протеинов (VP4, VP6(T13) и VP7). Протеин VP6(T13) наиболее консервативный и иммуногенный, и несет группо- и подгруппоспецифические детерминанты. Он не вызывает образование нейтрализующих антител, но играет роль в индукции протективного ответа, и используется в диагностических тестах. Гликопротеин внешнего чехла VP7 индуцирует образование типоспецифических вируснейтрализующих антител и используется для молекулярных и эпидемиологических исследований. В реакции нейтрализации в культуре клеток определено 14 типов гликопротеинов и G серотипов. Анализ сиквенса VP7 разных изолятов показал, что изоляты одной серогруппы имеют менее 10% вариабельности по сиквенсу, тогда как между серотипами этот показатель достигает 15-25%. На протеин VP4 также вырабатываются нейтрализующие антитела, но их использование в серотипировании менее приемлемо. В исследованиях по перекрестной нейтрализации идентифицировано 11 протеазных (Р) серотипов, с субтипами в четырех из них. Определено 19 генотипов по сиквенсу, кодирующему протин VP4 (вариабельность внутри одной геногруппы не превышает 10%).  В целом просматривается соответствие между серотипами и генотипами, но последним отдается приоритет. По другим ротавирусам пока нет соответствующих сведений о существовании и степени антигенной вариабельности.

Биологические особенности. Все ротавирусы очень трудно культивируются in vitro только в некоторых линиях эпителиальных клеток из почек обезьян. Инфекция этих клеток может быть усилена предварительной обработкой вируса трипсином. Сходная картина наблюдается и in vivo, когда репродукция вируса происходит только в окончательно дифференцированных энтероцитах, расположенных на вершинах микроворсинок эпителия тонкого кишечника. Отмечается несколько механизмов патогенеза, включая деструкцию энтероцитов, приводящую к нарушению процесса всасывания и осмотической диарее. До проявления гистологических изменений, часто отмечается водянистая диарея, которая считается секреторной, и вызываемой ротавирусным энтеротоксином. Наконец предполагается, что деструкция энтероцитов может приводить к потере барьера проницаемости между эпителием и кровеносной системой, что приводит к осмотическому выходу жидкости из системы циркулирования в кишечник. Ротавирусы инфицируют широкий спектр видов птиц и млекопитающих, чаще всего раннего возраста. Однако RV-B вызывает эпидемии у людей старшего возраста.

Критерии подразделения на виды внутри рода. Также как и в отношении представителей других родов семейства, определяющим критерием для классификации по видам является доказательство способности к реассортации генетических сегментов при коинфекции, с образованием жизнеспособного потомства. Однако на данный момент недостаточно сведений о реассортации между изолятами, и в основе методов идентификации отдельных изолятов лежат серологические исследования в совокупности с анилзом нуклеотидных или аминокислотных сиквенсов. На данный момент различают 5 видов ротавирусов (RV-A до Е) и два дополнительных вида (RV-F и RV-G).

Представители  видов рода могут быть идентифицированы по следующим признакам:

1) Способность к обмену генетическим материалом путем реассортации сегментов генома во время коинфекции, с образованием жизнеспособных вирионов.

2) Высокий уровень серологического перекрестного реагирования в ELISA, с использованием поли- или моноклональных антител, специфичных VP6(Т13) или его гомологам у других (не RV-A) вирусов.

3) Высокий уровень консервативности сиквенсов РНК в концевых и близлежащих к ним участков. Методом концевого фингерпринтинга определено два уровня консервативности сиквенсов: короткий консенсунсный сиквенс (10 нуклеотидов) по концам всех геномных сегментов и внутри сегментов – сегмент-специфические консенсунсные последовательности (по 40-50 нуклеотидов). Профиль фингерпринта различен для каждого вида вируса и может быть использован в диагностичесих целях.

4) Высокий уровень сходства сиквенсов РНК в консервативных сегментах генома. Вирусы внутри одного вида имеют вариабельность по сиквенсу не более 10% (сегмент 6, кодирующий VP6(T13)), тогда как вирусы разных видов проявляют вариабельность более чем на 30%. Такие различия также показаны для аминокислотного сиквенса вирусных протеинов, таких как VP2(Т2).

5) Идентификация по серотипу вируса с вирусным типом, уже классифицированным в качестве вида рода. Серотипы разных видов не спосбны к перекрестной нейтрализации.

6) Идентификация по специфичности виду-хозяину. Например, на данный момент RV-E был найден только у свиней. RV-D, а также предполагаемые RV-F и RV-G были выделены только от птиц.

 Виды (5 видов):

Предполагаемые виды (2): Rotavirus F (RV-F)     Chicken rotavirus F/A4 (AvRV-F/A4)

Rotavirus G (RV-G)     Chicken rotavirus G/555 (AvRV-G/555). Сцепленные гены не обязательно соответствуют сегментам РНК с тем же номером (например, у PoRV-C/Co сегменты 5-8 соответствуют таковым у SiRV-A/SA11 6, 7, 5 и 9, соответственно).

Род: Coltivirus. Типовой вид: Colorado tick fever virus (CTFV).

        Характерные особенности. Геном состоит из 12 сегментов двуспиральной РНК. Во время репликации вирусы обнаруживаются в цитоплазме клеток в ассоциации с гранулярными матрицами, филаментами или трубочками и извитыми нитями. Передача вирусов между позвоночными-хозяевами происходит посредством членистоногих переносчиков – клещей и москитов.

Характеристика вириона.

Морфология. Частицы диаметром 60-80 нм имеют два концентрических капсидных чехла и кор, имеющий диаметр 50 нм. Данные электронной микроскопии (негативное контрастирование) свидетельствуют об относительно гладкой (ровной) поверхности капсомерной структуры и экосаэдральной симметрии. Частицы обнаруживаются тесно связанными с филаментозными структурами и гранулярными матрицами в цитоплазме. Большинство вирусных частиц безоболочечные, хотя некоторые приобретают оболочечную структуру при прохождении через эндоплазматический ретикулум.

Плавучая плотность вириона в CsCl составляет 1,38 г/см³. Вирус остается стабильным при рН 7-8, но теряет инфекционность при рН 3. При температуре 4 ^оС вирус сохраняет активность в течение длительного периода в присутствии 50% сывортки крови плода КРС (фетальная сыворотка КРС) в 0,2 М Tris-HCl рН 7,8. Нагревание до 55 ^оС значительно снижает инфекционность вируса. Колтивирусы стабильны при обработке неионными детергентами, sodium lauroyl sarcosine или фреоном, но быстро разрушаются при обработке дезоксихолатом натрия или додецилсульфатом натрия. Ультразвуковая обработка средней мощности не приводит к деструкции частиц и может использоваться при очистке вируса. Вирус длительное время сохраняется при минус 80 ^оС, особенно при добавлении 50% сывортки крови плода КРС.

Геном. Геном представлен 12 сегментами dsRNA, которые обозначаются “геномный сегмент 1” – “геномный сегмент 12” в соответствии с уменьшением молекулярной массы или повышением электрофоретической подвижности при AGE. Геном состоит примерно из 21000 bp, а длина сегментов колеблется от 3,75 kbp до 756 bp.

Для подгруппы А колтивирусов (CTFV), при анализе размера геномной РНК в AGE, характерно выделение трех классов: крупные (L, сегменты 1-4), средние (M, сегменты 5-10) и мелкие (S, сегменты 11-12). Геном включает около 28 kbp (общая Mr 18х10⁶), длина сегментов от 675 bp до 14400 bp. Профиль генома в AGE Eyach virus (EYAV), также относящегося к подгруппе А сильно отличается от профиля CTFV. В подгруппе В также простматривается два профииля миграции геномной РНК в AGE: профиль 6-6 для Banana virus (BAV-In6423) и 6-5-1 для Kadipiro virus (KDV). Анализ перекрестной гибридизации РНК показал, что изоляты CTFV относительно гомогенны, и выделить отдельные серотипы проблематично (хотя некотрые вариации просматриваются в сегментах 4 и 6). Общее сходство по геномному сиквенсу по четырем мелким сегментам разных изолятов CTFV варьирует от 90% до 100%. Степень сходства по сиквенсу 12 сегмента изолятов CTFV и EYAV составляет 53-58%. Изоляты BAV проявляют вариабельность по профилю миграции, что свидетельствует о вариабельности первичной структуры. Общее сходство этих изолятов по нуклеотидному сиквенсу составляет 80-99% по сегменту 7 и 54-99 – по сегменту 9. Длина 5’-NTR и 3’-NTR исследованных сегментов разных колтивирусов составляет 14-17 и 35-249 нуклеотидов, соответственно. Состав G+C подгруппы А (48-52%) отличается от состава подгруппы В (37-39%).

Протеины.. Сегменты dsRNA и кодируемые ими протеины  колтивируса CTFV.

 Антигенные свойства. CTFV из Северной Америки и EYAF из Европы, классифицированные как разные виды, проявляют низкую перекрестную активность в реакции нейтрализации. Изолят S6-14-03, выделенный от зайца (Lepus californicus) в Северной Калифорнии, также считается отдельным видом (CTFV-Ca), серологически близким Eyach virus. Методы, основанные на использовании поли- и моноклональных антител, не показали наличия перекрестной активности между колтивирусами подгруппы В и CTFV. Таким образом выделяется четыре вида колтивирусов, принадлежащих двум разным подгруппам. Однако требуется дальнейший анализ неклассифицированного Китайского изолята, для подтверждения или исключения существования других видов.

Биологические особенности. Колтивирусы были выделены от нескольких видов млекопитающих (включая человека), а также от клещей (родов Dermacentor, Haemaphysalis, Otobius, Ixodes) и москитов/комаров (родов Culex и Anopheles), являющихся переносчиками. Аспирация крови от животных, инфицированных CTFV, взрослыми клещами и нимфами приводит к развитию у них персистентной инфекции, которая обеспечивает трансстадийную, но не трансовариальную передачу вируса. Сохранению вируса способствует также длительное (до 5 месяцев) вирусоносительство, наблюдаемое у некоторых грызунов. Инфицирование человека CTFV происходит при укусе инфицированным лесным клещем D. Andersoni. Передача от человека человеку была отмечена только как результат переливания крови. Наблюдающаяся у человека и грызунов продолжительная виремия, является результатом внутриэритроцитарной локализации вируса, защищающей его от воздействия иммунной системы.

Инфекция, вызванная CTFV характеризуется у людей внезапной лихорадкой, ознобом, головной и ретроорбитальной болями, светобоязнью, миалгиями и общим недомоганием. Абдоминальные боли встречаются в 20% случаев. Сыпь проявляется редко (менее 10%). Двух- или трехфазная лихорадка может сохраняться до 5-10 суток. Тяжелые формы болезни, включающие признаки поражения ЦНС или геморрагической лихорадки встречаются редко, в основном у детей до 12 летнего возраста. В некоторых случаях это заканчивается фатально. Может происходить внутриутробное заражение CTFV, однако риск аборта или смерти плода не известен. CTFV сопровождается лейкопенией у взрослых хомяков и, примерно, у 2/3 инфицированных людей. У мышат-сосунков, обычно погибающих на 6-8 сутки после заражения, обнаруживаются некроз миокарда, некробиотические изменения мозжечка, широкие очаговые некрозы и периваскулярные воспалительные процессы в коре мозга; отмечается дегенерация мышечной ткани, некрозы печени, сильная инволюция тимуса, некрозы ретины и бурого жира. У человека проявляется сходная патологоанатомическая картина: менингит, менингоэнцефалит, энцефалит, кровотечения в желудочно-кишечном тракте, пневмония, миокардит.

Инфекция, обусловленная CTFV, встречается у лесных обитателей гор Rocky Mountain, на высоте 4000-10000 футов, в Северной Америке. Антитела к вирусу были обнаружены у зайцев в Ontario, а выделение вируса регистрировалось в Long Island и NewYork. Eyach virus широко распространен в Европе. Изоляты BAV были выделены в 1987 г из цереброспинальной жидкости и сыворотки крови пациентов с признаками лихорадки и энцефалита. Индонезийские изоляты были выделены исключительно от москитов. Хотя клиническое проявление инфекций, вызванных BAV и KDV, документировано не так хорошо, как для CTFV, предполагается широкое их распространение в странах Юго-Востчной Азии.

Критерии подразделения на виды внутри семейства.

Также как и в отношении представителей других родов семейства, определяющим критерием для классификации по видам является доказательство способности к реассортации генетических сегментов при коинфекции, с образованием жизнеспособного потомства. Однако на данный момент недостаточно сведений о реассортации между изолятами, и в основе методов идентификации отдельных изолятов лежат серологические исследования в совокупности с анилзом нуклеотидных или аминокислотных сиквенсов.

Представители видов  рода могут быть идентифицированы по следующим признакам:

1) Способность к обмену генетическим материалом путем реассортации сегментов генома во время коинфекции, с образованием жизнеспособных вирионов.

2) Результаты анализов на основе методов перекрестной гибридизации (northern или dot-blot, с зондами из РНК или кДНК). Внутри одного семейства значение сходства РНК сиквенсов достигает 74%, при гибридизационных условиях с Tm (РНК) 36 ^оС.

3) Серологический анализ с использованием РСК и реакции нейтрализации. Изоляты CTFV проявляют высокий уровень перекрестной нейтрализации. Перекрестная нейтрализация между видами CTFV и EYAV (подгруппа А) детектируется только в РСК. Вирусы подгрупп А и В не прявляют значимой перекрестной активности.

4) Сравнительный анализ сиквенсов (сегментов 7-12). Внутри одного вида проявляется высокий уровень сходства сиквенсов по консервативным сегментам, например, по сегменту 12 вариабельность не превышает 11%.

5) Сравнительный анализ аминокислотных сиквенсов продуктов сегмента 12, показывает вариабельность между видами более 50%.

6) Сравнительный анализ электрофоретипа в AGE. Внутри одного вида профиль электрофоретипа достаточно стабилен. Однако в случае делеций или вставок (в сегментах 7 и 9) электрофоретип может изменяться.

7) Сравнительный анализ консервативных концевых последовательностей РНК. Данные поледовательности проявляют консервативность на уровне вида. Сиквенс 3’-концов некоторых сегментов может быть консервативных у разных видов.

8) Анализ G+C состава вирусной РНК. Виды, принадлежащие одной подгруппе, имеют сходный G+C состав. Сегменты РНК видов CTFV и EYAV, принадлежащих подгруппе А, имеют состав G+C 48-52%, тогда как сегменты видов BAV и KDV, принадлежащих группу В, имеют G+C состав 37-39%.

CTFV-S6-14-03, выделенный от зайца в Калифорнии в 1976 г, проявляет одностороннюю перекрестную реактивность в реакции нейтрализации с Eyach virus, но имеет значительные отличия и считается отдельным серотипом. Также сообщалось о серологических вариантах Eyach virus (Eyach virus (France 577) и Eyach virus (France 578)). Недавно были выявлены несколько Индонезийских (BAV-In6493, BAV-In6969, BAV-In7043 и KDV-Ja7075) и Китайских (BAV-Ch, BAV-HN59, BAV-HN131, BAV-HN191, BAV-HN295) изолятов, серологически отличающиеся от подгруппы А. Анализ этих изолятов позволяет идентифицировать четыре разных вида. Статус Китайских изолятов остается неясным.

Виды (4 вида):

Предполагаемые виды (4): Banna virus (China-HN59), (BAV-HN59V), Banna virus (China-HN131) (BAV-HN131V), Banna virus (China-HN191), (BAV-HN191V) Banna virus (China-HN295) (BAV-HN295V).

Род: Aquareovirus. Типовой вид: Aquareovirus A (ARV-A) (аквареовирус А).

  Характерные особенности. Аквареовирусы внешне напоминают ортореовирусы, но имеют геном из 11 сегментов dsRNA. Инфицируют различных водных животных, включая рыб и ракообразных. Аквареовирусы репродуцируются в культурахе клеток из тканей органов рыб и млекопитающих, при температуре 15-25 ^оС. Характерный ЦПЭ проявляется в виде синцития.

Характеристика вириона. Морфология. Вирусные частицы сферические, икосаэдральной симметрии (80 нм в диаметре), с двумя концентрическими капсидными чехлами, сформированными тремя протеиновыми слоями. Внешний капсид, толщиной 10 нм, окружает кор, имеющий диаметр 60 нм. Промежуток между внешним капсидом и внутренним кором, при электронной микроскопии с негативным контрастированием, выгдядит в виде четкого светлого кольца. Небольшие поверхностные отростки соединяют внутренние и внешние капсидные слои. Коровая частица содержит также внутренний слой, содержащий 11 геномных сегмента dsRNA и внутренние коровые протеины (транскриптазный комплекс). Морфология аквареовирусных частиц очень напоминает субвирусные частицы ортореовирусов, однако, главным отличием является отсутствие у аквареовирусов гемагглютинирующих спайков (отростков). Плавучая плотность вириона в CsCl составляет 1,36 г/см³; S_W20 550 S. Инфекционность вируса стабильна при рН 3-10 и при обработке эфиром или хлороформом. Воздействие 3 мМ EDTA или солей цезия к потере белков не приводит. При температуре 4, 16 или 23 ^оС в среде (МЕМ) с 5% сыворотки инфекционность аквареовирусов не снижается в течение 28 суток. Инфекционность утрачивается при хранении при 45 ^оС в течение 7 суток или при нагревании до 56 ^оС.

Геном. Геном представлен 11 сегментами dsRNA (общая Mr 16,0х10⁶), представленные в вирусной частице в эквимолярном соотношении. Сегменты имеют Mr 0,4-2,5х10⁶ и обозначаются “геномный сегмент 1” – “геномный сегмент 11” в соответствии с уменьшением молекульрной массы или повышением электрофоретической подвижности в 1% агарозном геле. По размеру (профилю миграции) сегменты подразделяются на 3 класса: крупные (L, сегменты 1-3, Mr 2,5-2,3 х 10⁶), средние (M, сегменты 4-6, Mr 1,9-1,6 х 10⁶) и короткие (S, сегменты 7-11, Mr 1,0-0,37 х 10⁶). По взаимной РНК-РНК гибридизации определено 6 видов (AVR-A-F). Электрофоретический профиль одинаков для членов одного вида. Данный профиль может различаться в пределах одного вида, если геномные сегменты анализируются в полиакриламидном геле (>6%).

Другие компоненты вириона. Вирион ARV-A содержит 7 структурных протеинов: VP1 (Mr 130x10³)  - внутренний капсид (кор); VP2 (Mr 127x10³) - внутренний капсид (кор); VP3, Mr 126x10³) - внутренний капсид (кор); VP4 (Mr 73x10³) - внутренний капсид (кор);  VP5 (Mr 71x10³) - минорный, внешний капсид, VP6 (Mr 46x10³) - внутренний капсид (кор), VP7 (Mr 35x10³) -мажерный, внешний капсид.Вирус кодирует 5 неструктурных протеинов: NS1 (Mr 97x10³); NS2 (Mr 39x10³); NS3 (Mr 29x10³); NS4 (Mr 28x10³); NS5 (Mr 15x10³).

Липидных компонентов нет, VP7 ARV-A может быть гликозилирован.

Антигенные свойства. Внешние капсидные протеины аквареовирусов не обладают гемагглютинирующей активностью. Вирусы имеют типо- и группоспецифические антигенные детерминанты. Вирусы одного вида антигенно близки. Незначительная антигенная перекрестная реактивность была показана только между ARV-A и ARV-B. Вероятно внутри видов существуют разные серотипы. Мажерный внешний капсидный протеин ARV-A (VP7) не является мажерным антигеном нейтрализации.

Биологические особенности. Аквареовирусы были выделены от пойкилотермных позвоночных и беспозвоночных животных, обитающих в пресной и соленой воде. Вирусы хорошо репродуцируются в клеточных линиях из тканей рыб при температуре 15-25 ^оС, с проявлением ЦПЭ в виде синцития. Вирусы обычно слабопатогенны для своих хозяев. Однако grass carp reovirus очень патогенен для карпов (grass carp). Инфекционность аквареовирусов повышается при обработке трипсином или хемотрипсином, что коррелирует с разрушением внешнего капсидного протеина (VP7).

Критерии подразделения на виды внутри рода. Как и в отношении представителей других родов семейства, определяющим критерием для классификации по видам является доказательство способности к реассортации генетических сегментов при коинфекции, с образованием жизнеспособного потомства. Однако на данный момент для аквареовирусов таких данных нет. Поэтому, наиболее употребительными являются методы на основе перекрестной РНК-гибридизации и серологические тесты. Представители видов  рода могут быть идентифицированы по следующим признакам:

1) Способность к обмену генетическим материалом путем реассортации сегментов генома во время коинфекции, продуцируя жизнеспособные вирионы.

2) Результаты анализов на основе методов перекрестной гибридизации (Northern или dot-blot, с зондами из РНК или кДНК). Например, при гибридизации по Northern, при условиях (stringency), не дающих более 17 ошибочных спариваний, будет наблюдаться только внутривидовая гибридизация.

3) Сравнительный анализ сиквенсов сегментов. Например, геномный сегмент 10, кодирующий мажерный капсидный протеин VP7, проявляет вариабельность по нуклеотидному составу более 45% между вирусами разных видов. По аминокислотному составу (VP7) вариабельность достигает 64%.

4) Серологический анализ на основе реакции нейтрализации (или других методов) с использованием поли- или моноклональных антител, специфичных консервативным антигенам. Результаты перекрестной нейтрализации совпадают с результатами перекрестной гибридизации.

5) Сравнительный анализ электрофоретипа в AGE. Внутри одного вида профиль электрофоретипа достаточно стабилен. Могут наблюдаться сходные электрофоретипы отдельных сегментов разных видов. Однако в случае делеций или вставок (в сегментах 7 и 9) электрофоретип может изменяться.

6) Сравнительный анализ консервативных концевых последовательностей сегментов геномной РНК. Некоторые близкородственные виды имеют идентичные концевые последовательности у некоторых сегментов.

На основе РНК-гибридизации выделено 6 видов, и пять видов предполагаемых.

Виды (6 видов):

Предполагаемые виды (5): Chub reovirus (CHRV), Grass carp reovirus (GCRV)

Hard clam reovirus (HCRV), Landlocked salmon reovirus (LSRV), Tench reovirus (TNRV).

Род: Cypovirus. Типовой вид: Cypovirus 1 (CPV-1).

Характерные особенности. Вирусы данного рода инфицируют и патогенны только для членистоногих определенных видов. К культурам клеток адаптировать не удалось. При температуре выше 35 ^оС репликация вируса прекращается. Распространение вируса происходит в составе полиэдров, попадающих в корм. Большинство вирусов вызывают хронические болезни с поражением пищеварительного тракта, нарушением развития личинок, но редко сопровождается их смертностью.

Диаметр частиц 55-69 нм. Вирион имеет только одну капсидную оболочку с поверхностными выступами (спайками). Геном представлен 10 сегментами dsRNA. Геном кодирует 5 протеинов. Для проникновения в клетку и инициации транскрипции не требуется модификации вириона, так как они (транскриптазные и кэпирующие энзимы активны без модификации частиц, и также сохраняют РНК-полимеразную активность при разрушении (при многократном замораживании-оттаивании) частицы. Вирусные частицы могут концентрироваться при участии вирусного протеина, формируя полиэдры в цитоплазме клеток. Для идентификации видов используются методы анализа электрофоретипа геномных dsRNA структурных и полиэдринового протеинов. Изоляты с одинаковым элктрофоретипом РНК проявляют высокий уровень антегенной перекрестной реактивности по данным протеинам. Всего 14 официально и 2 предполагаемых вида.

Род: Fijivirus. Типовой вид: Fiji disease virus (FDV).

 Характерные особенности. Инфицируют только насекомых (Nilaparvata lugens reovirus, NLRV) или (Fijiviruses) еще и растенияя определенных видов семейства Graminae или Liliaceae. Фидживирусы широко распространены в природе, но не обнаружены в Северной Америке, об их обнаружении в Африке и Индиии точных данных нет.

Вирионы имеют икосаэдральную симметрию, с двумя оболочками, больше округлой, чем угловатой, формы (d 65-70 нм), с короткими отростками (спайками типа А). Геном представлен 10 сегментами dsRNA. Идентифицировано 6 вирусных протеинов.

Официально идентифицировано 8 видов фидживирусов, разделенных на пять групп (по анализу нуклеотидных и аминокислотных сиквенсов).

Люди также интересуются этой лекцией: Основные свойства организаций будущего.

Род: Phytoreovirus. Типовой вид: Wound tumor virus (WTV).

     Характерные особенности. Основными хозяевами являются растения. Между восприимчивыми растениями вирусы распространяются цикадами, в которых вирус также репродуцируется и передается трансовариально. Механической передачи вирусов не отмечается. Вирионы икосаэдральной симметрии, имеют угловатую поверхность (d 70 нм). Геном представлен 12 сегментами dsRNA. Идентифицировано 6-7 структурных вирусных протеинов. Антигенного родства по внешним капсидным протеинам у вирусов разных видов нет.Официально идентифицировано 3 вида вирусов и 1 вид предполагаемый.

Род: Oryzavirus. Типовой вид: Rice ragged stunt virus (RRSV).

  Характерные особенности. Основными хозяевами являются растения (семейства Graminae). Между восприимчивыми растениями вирусы распространяются определенными видами насекомых, в которых вирус также репродуцируется (трансовариально не передается). Механической передачи вирусов не отмечается. Распространены в странах Юго-Восточной Азии и Дальнего Востока, в Тайвани; наносят значительный ущерб в рисоводстве (потери урожая 20-100%).

Интактные вирионы икосаэдральной симметрии, с 2 белковыми оболочками (диаметр 75-80 нм), имеют выросты (спайки) типов А и В. Геном представлен 10 сегментами dsRNA. Идентифицировано 5 структурных и 3 неструктурных вирусных протеина. Выражено значительное антигенное родство по некоторым протеинам обоих видов вирусов. Всего официально идентифицировано 2 вида вирусов.

Неклассифицированные вирусы семейства. Описано 7 видов вирусов, выделенных от насекомых, 3 вида – от ракообразных и 1 вид – от паукообразных.