Объем распределения

2. Объем распределения

Если вещество в дозе "Д" ввести внутривенно и оно, в соответствии со способностью преодолевать гистогематические барьеры и клеточные мембраны, распределится в жидкостях и тканях организма, то, основываясь на определении его концентрации в плазме крови "С", можно рассчитать кажущийся объем распределения (V_d).

Сравнивая V_d с объемами различных компартментов, можно ориентировочно оценить, в каком из них будет преимущественно накапливаться вещество. У взрослого человека масса воды составляет 50 - 70% от массы тела (у мужчины - 60 - 65%, у женщины - 50 - 55%) (табл. 2). Объем плазмы крови равен 4 - 4,5%, экстрацеллюлярной жидкости - 11 - 13%.

Таблица 2. Относительный объем компартментов организма

Если вещество не растворимо в липидах, оно будет накапливаться в водной фазе: плазме крови V_К или одновременно внеклеточной V_E и внутриклеточной V_C жидкости. Если допустить, что вода этих жидкостей имеет одинаковую способность растворять химические соединения, можно ожидать, что:

С = Д/(V_К + V_E + V_C)

Если вещество распределится только внутри сосудистого русла:

С = Д/(V_К),

если экстрацеллюлярно:

С = Д/(V_К + V_E).

В ходе токсикологических исследований принято определять абсолютный и относительный объемы распределения:

V_абс = Д/С (л);

V_относ = Д/С М (л/кг), где

Доза - "Д" выражается в граммах; концентрация - "С" в г/л; масса тела - "М" в кг.

При умножении V_относ на 100 получаем его значение в % от массы тела.

Например, после внутривенного введения химического вещества (Д = 0,5 г) человеку массой 60 кг при установления состояния равновесия в организме концентрация его в плазме крови равна 0,04 г/л. В результате имеем:

V_абс = 0,5/0,04 = 12,5 л

V_относ = 12,5/60 = 0,208 , т.е. 20,8%

Таким образом, можно предположить, что соответствующее соединение главным образом накапливается экстрацеллюлярно.

Значения объемов распределения некоторых веществ в организме человека представлены на таблице 3.

Таблица 3. Объем распределения некоторых ксенобиотиков

(цит. по Марковой И.В., 1998)

Многие вещества имеют относительный объем распределения более 70 и даже более 100%. Этот на первый взгляд лишенный смысла факт, указывает на то, что соединения активно связываются со структурными элементами клеток, депонируются в тканях (преимущественно в жировой). Концентрация их в плазме крови при этом остается низкой.

Поэтому до изучения растворимости вещества в липидах, его способности связываться с белками крови и тканей и т.д., интерпретация результатов носит сугубо предварительный характер. Поскольку содержание жира у разных людей неодинаково объем распределения для липофильных веществ также подвержен существенным колебаниям.

Анализ величины объема распределения сопряжен и с другими трудностями. Так, если вещество достаточно быстро удаляется из организма, существенное значение приобретает правильность выбора времени определения его концентрации в плазме. Если это сделано слишком рано, не успевает установиться равновесие в системе распределения ксенобиотика, если слишком поздно - большая часть вещества будет элиминирована из организма.

Для преодоления трудностей необходимо использовать дополнительные методические приемы, в частности определять величину полуэлиминации токсиканта (см. ниже).

3. Связывание с белками крови

Токсикант, попавший в кровоток, может вступать во взаимодействие с белками и клетками крови, при этом изменяются его токсикокинетические характеристики. В практическом отношении особый интерес представляет взаимодействие ксенобиотиков с протеинами плазмы крови.

3.1. Белки плазмы крови

Плазма крови человека содержит около 75 мг/мл белка. Основная масса представлена альбуминами: 35 - 55 мг/мл, выполняющими, главным образом, транспортные функции. К числу других групп относятся белки свертывающей системы крови, иммуноглобулины, белки системы комплемента, ингибиторы протеолиза, липо- и гликопротеины. Взаимодействие этих белков с ксенобиотиками приводит к понижению концентрации свободно циркулирующих в плазме веществ, вследствие чего понижается фракция токсиканта, способного к диффузии в ткани. Липофильные вещества, взаимодействуют в основном с липопротеинами. Водо-растворимые токсиканты прежде всего связываются с альбуминами и кислыми ₁-гликопротеидами. Концентрация последних в плазме крови составляет около 0,9 мг/мл. Потенциальные участки связывания заряженных молекул ксенобиотиков белками представлены в таблице 4.

Таблица 4. Потенциальные участки связывания ионизированных молекул ксенобиотиков белками

Tanford et al. 1955

Альбумины плазмы крови человека хорошо растворяются в воде. Их молекулярная масса - около 66000 Д. Они состоят из 585 остатков аминокислот. Третичная структура альбуминов фиксируется 17 дисульфидными связями. При рН 7,4 эти белки находятся в форме анионов. Большинство попавших в кровь веществ фиксируются на альбуминах, не зависимо от того являются они нейтральными, кислыми или основными соединениями.

Выделяют 6 основных центров связывания ксенобиотиков на молекуле альбумина. Различные центры отличаются друг от друга неодинаковым сродством к веществам с различными значениями константы рК_а, механизмами взаимодействия с ксенобиотиками, различной кривой насыщения связи, числом на молекуле белка, величинами константы диссоциации комплекса белок-ксенобиотик. Так, центр связывания 1-го типа содержит два различных акцепторных ареала. Здесь связываются такие вещества как варфарин, бензодиазепины. На 1 молекулу альбумина приходится 1 - 3 центра связывания 1-го типа.

Физиологическая функция альбуминов состоит в связывании свободных жирных кислот и билирубина, циркулирующих в крови. Эти вещества могут влиять на процесс взаимодействия белков с ксенобиотиками. Так, жирные кислоты ослабляют связывание гликозидов или бензодиазепинов с альбуминами. Билирубин влияет на фиксацию варфарина и т.д.

Кислые ₁-гликопротеиды состоят из одной полипептидной цепи и остатка углевода. Молекулярная масса белков - около 41000. Полисахаридный фрагмент молекулы составляет около 38% ее массы. Гликопротеиды связывают, прежде всего, молекулы, обладающие свойствами слабых оснований. Из-за невысокой концентрации этих белков в плазме процесс связывания ими химических веществ быстро насыщается.

Липопротеиды прежде всего связывают жирорастворимые вещества. Основной центр связывания - липидный фрагмент молекулы.

Кроме указанных, в плазме крови содержатся специфические транспортные белки, активно связывающие некоторые токсиканты (церулоплазмин, металотионеины и т.д.).

3.2. Характеристики связывания ксенобиотиков

Перечень связывающихся на белках крови молекул простирается от простых неорганических до сложных макромолекулярных соединений. Достаточно хорошо это явление изучено применительно к разнообразным лекарственным препаратам (таблица 5).

Таблица 5. Связывание некоторых лекарственных препаратов белками плазмы крови

( цит. по Марковой И.В., 1998)

Связь веществ с белками - спонтанно протекающая реакция, не требующая затрат энергии и зависящая только от их строения.

В основе процесса, как правило, лежит установление гидрофобных, реже ионных и водородных, связей между участниками взаимодействия. Установлено, что с увеличением молекулярной массы ксенобиотика, длины алкильных радикалов в молекуле вероятность его связывания белками возрастает. Включение в молекулу галогенов делает связь вещество-белок более прочной. Влияние различных заместителей возрастает в ряду: Cl< Br< J. Наличие N-ацильных радикалов в молекуле также упрочивает связь. Галогенированные углеводороды прочно связываются с альбуминами, но еще прочнее с липопротеинами. Липофильные ФОС связываются и с альбуминами и с липопротеинами (таблица 6).

Таблица 6. Связывание ксенобиотиков различного строения с альбуминами и липопротеинами

* ЛПНП - липопротеины низкой плотности

**ЛПВП - липопротеины высокой плотности

(Malwall B.P., Guthrie F.E., 1981)

Связывание с белками - один из важных факторов, определяющих особенности токсикокинетики некоторых металлов. Ключевую роль здесь играют низкомолекулярные, содержащие SH-группы металлсвязывающие белки - металлотионеины, усиленно синтезируемые в ответ на поступление целого ряда металлов (Сd, Zn и т.д.) в организм. Эти белки активно соединяются с металлами, формируя ковалентную связь, и при острых воздействиях снижают их токсичность. Так, предварительное введение экспериментальным животным цинка, индуцирующего синтез металлотионеинов, защищает их от смертельной дозы Сd (Gunn et al., 1964). Печень и почки - органы, в которых синтез металлотионеинов проходит с наивысшей скоростью. Именно в этих органах первоначально накапливается и большая часть металла, поступившего в организм. При длительном поступлении в организм (хорошо изучено на примере кадмия) комплекс металл-металлотионеин появляется в крови. Источником циркулирующего в крови комплекса, как полагают, является печень. Интересно отметить, что накопление связанного кадмия в почках в большом количестве приводит к развитию нефропатии. Комплекс Сd-металлотионеин при системном введении экспериментальным животным вызывает некроз клеток эпителия проксимального отдела почечных канальцев. Вероятно, в этих структурах происходит захват циркулирующего в крови Сd-металлотионеина. У грызунов, которым хронически вводили Сd, нефропатия не развивалась до тех пор, пока концентрация комплекса Сd-металлотионеин в сыворотке крови не становилась достаточно высокой.

3.3. Конкурентные отношения при взаимодействии ксенобиотиков с белками

Если в растворе белка находится несколько химических соединений, между ними могут возникнуть конкурентные отношения за образование связи с протеинами. Эту закономерность легко проследить на примере сульфониламидных препаратов и фенобарбитала. При увеличении концентрации барбитурата (с 0,85 мМ до 3, 25 мМ) количество сульфониламида, связавшегося с альбумином плазмы крови человека уменьшается. Подобные отношения отмечаются между веществами как близкого, так и совершенно разного строения, вместе с тем не являются облигатными для всех соединений. Более того, в ряде случаев выявляется усиление связи веществ с протеинами в присутствии других соединений. Так, галотан повышает способность альбумина связывать самые различные химические вещества, вероятно модифицируя его конформацию.

Известна способность веществ к взаимному вытеснению из связей с протеинами. Это особенно характерно для слабых кислот, например таких лекарственных препаратов, как фенилбутазон, сульфинпиразон и т.д. Вследствие высвобождения из связи с белком концентрация действующего соединения в плазме крови возрастает.

Значение рассматриваемого явления определяется следующими факторами:

- относительным сродством вещества и его конкурента к белкам плазмы крови с одной стороны, и тканям - с другой;

- объемами, в которых распределяются вещества;

- скоростью разрушения комплекса токсикант-белок.

Если объем распределения вещества невелик и при этом в плазме крови обнаруживается его высокая концентрация в сравнении с тканями, то вытеснение из связи с белками крови заметно изменит содержание соединения в тканях. Для веществ с большим объемом распределения вытеснение практически не скажется на характере распределения в организме.

При попадании в кровь нескольких биологически активных веществ, конкурирующих за один и тот же участок связывания на белках плазмы крови, возможна существенная модификация их токсичности и продолжительности действия. Так, при введении экспериментальным животным фенилбутазона или его производных, на фоне предварительного введения переносимой дозы антикоагулянтов (варфарина, кумарина), отмечается вытеснение последних из связи с белками плазмы крови, что приводит к гибели животных.

При изучении явления конкуренции веществ необходимо учитывать, что ксенобиотики помимо связи с белками плазмы крови, как правило, образуют комплексы и с тканевыми протеинами (таблица 7).

Таблица 7. Связывание веществ (0,1 М) in vitro 50% гомогенатом мышечной ткани, 25% раствором гемоглобина и плазмой крови человека

(H. Kurz, 1978)

Введение в организм конкурентов связывания может привести к высвобождению соединения не только из комплекса с белками плазмы, но и тканей. В этом случае диффузионный градиент высвобождаемого вещества может измениться самым неожиданным образом (таблица 8).

Таблица 8. Изменение количества связанного веществ (0,1 мМ) при добавлении в инкубат фенилбутазона (0,1 мМ)

* 25% раствор гемоглобина; 50% гомогенат мышечной ткани

** М - человек; К - кролик. (Н.Kurz, 1978)

3.4. Биологические последствия связывания токсиканта белками плазмы крови

Связывание веществ белками крови имеет определенные токсикокинетические и токсикодинамические последствия.

1. Распределение. Простые вещества, связанные с белками крови, приобретают кинетические характеристики этих белков. Содержание таких веществ в тканях, как правило, невелико, объем распределения - мал (плазма крови). Напротив, у веществ, плохо связывающихся с белками, объем распределения и содержание в тканях высокие. Если распределение вещества в организме не подчиняется законам диффузии и осуществляется путем активной его экстракции из крови тканями (например, печенью или почками), то связывание белками может даже способствовать активному захвату такого ксенобиотика (например, захват почками комплекса кадмия с металлотионеинами).

2. Клиаренс. Клиаренс (скорость "очищения" плазмы - Cl) определяется интенсивностью кровотока (F) и скоростью экстракции вещества органами выведения (Е):

Cl = F E;

Е = (С_А - С_V)/C_А , где

С_А и С_V - концентрация вещества в артериальной и венозной крови соответственно.

Если Е имеет высокие значения (более 0,7 - 0,8), клиаренс в значительной степени зависит от интенсивности кровотока. При этом, соотношение между свободной и связанной фракциями токсиканта в крови играет подчиненную роль. Так, даже если в печени и почках из плазмы экстрагируются преимущественно несвязанная форма, то, вероятно, быстрая диссоциация комплекса вещество-белок приводит к практически незатрудненному выведению вещества.

Если Е - менее 0,2 - 0,3, клиаренс определяется, прежде всего, концентрацией несвязанного вещества в плазме крови. Интенсивность кровотока имеет меньшее значение.

3. Выведение через почки. Если вещество не подлежит активному захвату почечной тканью, то в случае связывания с белками его экскреция будет затруднена, поскольку капиллярная мембрана почечных клубочков не проницаема для белка. В первичную мочу путем фильтрации будут поступать лишь свободные молекулы.

В этой связи если диссоциация комплекса вещество-белок проходит быстро, то связывание ксенобиотика протеинами крови мало сказывается на его выделении через почки, если же образовалась прочная связь, это может стать лимитирующим фактором почечной экскреции.

Рекомендуем посмотреть лекцию "Основные технологические решения при разработке нефтяных месторождений с заводнением и их геологическое обоснование".

4. Биологическое действие. Биологическое действие вещества пропорционально части молекул, вступивших во взаимодействие с биологически значимыми молекулами-мишенями. Эта часть, в свою очередь является функцией концентрации свободных, не связавшихся с биосубстратом, молекул. Все структурные элементы организма, способные образовывать комплексы с ксенобиотиками, являются конкурентами специфических рецепторов для токсикантов, понижают их биологическую активность. Это в полной мере относится к белкам крови и тканей. Последние существенно превосходят белки крови по способности неспецифически связывать ксенобиотики и потому в большей степени влияют на токсикодинамические характеристики веществ.

5. Аллергизация. Некоторые ксенобиотики, образуя ковалентные связи с молекулами белков, изменяют структуру протеинов и их конформацию, белки приобретают свойства антигенов для собственного организма. С учетом этих представлений обсуждается возможность объяснения аллергизации организма низкомолекулярными соединениями, наблюдаемая при их повторном воздействии (см. раздел "Иммунотоксичность").

4. Связывание клетками крови

В крови токсикант может вступать во взаимодействие не только с белками плазмы, но и форменными элементами крови и прежде всего с эритроцитами. При этом возможно: 1. Связывание вещества клеточной мембраной эритроцитов (связывание с белками мембраны, растворение в липидах клеточной мембраны); 2. Проникновение соединения внутрь клетки, связывание с её содержимым, взаимодействие с гемоглобином.

Фиксация веществ на поверхности эритроцитов отчасти обусловлена наличием отрицательного заряда на внешней поверхности мембраны. Он формируется многочисленными связанными с мембраной молекулами мукополисахаридов. Положительно заряженные вещества, особенно содержащие четвертичный атом азота в молекуле (алкалоиды и т.д.), активно взаимодействуют с поверхностью эритроцитов.

Прохождение ксенобиотиками клеточной мембраны эритроцитов подчиняется общим закономерностям (см. выше). Из-за высокой концентрации гемоглобина в эритроците вся внутриклеточная вода связана этим белком и не принимает участие в растворении ксенобиотиков. В этой связи, возможности эритроцитов фиксировать гидрофильные молекулы в форме раствора внутри клетки, ограничены.