- Фракионирование клеток

Лекция № 13.

Количество часов: 1

Фракционирование клеток

В цитологии широко применяют различные методы биохимии, как аналитические, так и препаративные. В последнем случае можно по­лучить в виде отдельных фракций разнообразные компоненты и изу­чать их химический состав, ультраструктуру и свойства. Так, в настоя­щее время в виде чистых фракций получают практически любые кле­точные органеллы и структуры: ядра, ядрышки, хроматин, ядерные оболочки, плазматическую мембрану, вакуоли эндоплазматического ретикулума, его рибосомы, рибосомы гиалоплазмы, аппарат Гольджи, митохондрии, их мембраны, пластиды, пероксисомы, микротрубочки и др. В последнее время получены чистые фракции центриолей и ядер­ных пор.

Получение клеточных фракций начинается с общего разрушения клетки, с ее гомогенизации. Затем из гомогенатов уже можно выделять фракции. Одним из основных способов выделения клеточных структyp является дифференциальное (разделительное) центрифугирование. Принцип его применения в том, что время осаждения частиц в гомогенате зависит от их размера и плотности: чем больше частица или чем она тяжелее, тем быстрее она осядет на дно пробирки. Для убыстрения процесса оседания варьируют ускорения, создаваемые центрифугой. При центрифугировании раньше всего и при небольших ускорениях осядут ядра и неразрушенные клетки, при 15—30 тыс. g осядут крупные частицы, макросомы, состоящие из ми­тохондрий, мелких пластид, пероксисом, лизосом и др., при 50 тыс. g осядут микросомы, фрагменты вакуолярной системы клетки. При повторном дробном центрифугировании этих смешанных подфрак-ций можно получить чистые фракции. Так, при разделении макросомной подфракции получают отдельно митохондрии, лизосомы, перок­сисомы. При разделении микросом можно получить фракцию мемб­ран аппарата Гольджи, фрагментов плазматической мембраны, вакуо­лей, гранулярного ретикулума. В случаях более тонкого разделения фракций используют центрифугирование в градиенте плотности саха­розы, что позволяет хорошо разделить компоненты, даже незначи­тельно отличающиеся друг от друга по удельной массе.

Прежде чем выделенные фракции анализировать биохимическими способами, необходимо проверить их на чистоту с помощью элек­тронного микроскопа.

Получение отдельных клеточных компонентов дает возможность изучать их биохимию и функциональные особенности. Так можно создать бесклеточную систему для рибосом, которые будут синтезиро­вать белок по заданной экспериментатором информационной РНК. Выделенные митохондрии в подобранных условиях могуг осуществлять синтез АТФ, на выделенном хроматине при участии соответству­ющих ферментов может происходить синтез РНК и т.д.

В последнее время применяются бесклеточные системы для воссо­здания клеточных надмолекулярных структур. Так, используя очищен­ные от гранул желтка экстракты цитоплазмы яиц земноводных или яиц морских ежей, можно получить ядра с ядерной оболочкой из вве­денной в эту бесклеточную систему чужеродной ДНК (например, ДНК бактериофага). Такая ДНК связывается с белками-гастонами, которые есть в избытке в таком экстракте, образуется хроматин (дезоксирибонуклеопротеид), который покрывается двойной мемб­ранной оболочкой, несущей даже ядерные поры. Такие модельные си­стемы помогают изучать тонкие, интимные процессы, например транспорт макромолекул из цитоплазмы в ядро, и наоборот. В цито-плазматических экстрактах яиц земноводных и иглокожих такие ядра могут периодически делиться путем митоза. Эти модели внесли огром­ный вклад в расшифровку природы регуляции клеточного цикла.

Большой вклад в биологию клетки вносят методы клеточной инже­нерии. Найдено, что различные живые клетки могут сливаться друг с другом, если специальными способами обработать их плазматические мембраны. Так можно слить эритроцит курицы и лимфоцит человека. При этом получается двуядерная клетка — гетерокарион, в котором происходит активация ядра куриного эритроцита (рис. 14). Если гете­рокарион образуется из близкородственных клеток (например, мыши и хомячки), то при вступлении их в митоз хромосомы могут объеди-

Рекомендуемые материалы

После разделения такой клетки получится истинно гибридная клетка. Другие приемы позволяют конст­руировать клетки из разных по происхождению ядер и цитоплазмы (рис. 15). Так, разрушив актиновый компонент цитоскелета и подвергнув клетки центрифугированию, клетку можно разделить на две части: ядро с узким ободком цитоплазмы — кариопласт и на оставшуюся часть цито­плазмы — цитопласт. Затем, используя разные кариопласты и цитопла-сты, можно создавать разные комбинации реконструированных клеток.

Методы клеточной инженерии широко применяются не только в экспериментальной биологии, но и в биотехнологических целях. На­пример, при получении моноклональных антител используются кле­точные гибриды между лимфоцитами иммунизированных животных и интенсивно размножающимися клетками миеломы. Полученные пер­вичные дикарионы образуют истинные гибридные клетки, которые и нтенсивно размножаются за счет генома опухолевых миеломных кле­ток, и одновременно выделяют большое количество антител за счет работы генома иммунизированных лимфоцитов. Этот прием позволя­ет получать большое число гибридомных клеток, вырабатывающих большие количества необходимых антител.

Нет необходимости приводить описание всех методов и приемов, используемых в цитологии для изучения строения, химии и функций клеток или их компонентов. Этого краткого обзора достаточно для то­го, чтобы показать богатство арсенала методов в цитологии, позволя­ющих давать точный анализ, начиная от формы, общего вида и разме­ра клетки и кончая молекулярной композицией ее отдельных частей.

Пероксисомы (микротельца)

Это небольшие вакуоли (0,3—1,5 мкм), одетые одинарной мсмбр| ной, отфаничивающей гранулярный матрикс, в центре которою рас полагается сердцевина, или нуклеоид (ничего не имеющий общего с нуклеоидом бактерий и вообще к ядерным структурам не относящийся)

В зоне сердцевины часто, особенно в пероксисомах печеночных клеток, видны кристаллоподобные структуры, состоящие из регулярно упакованных фибрилл, или трубочек. Изолированные сердцевины пероксисом содержат фермент уратоксидазу.

Пероксисомы обнаружены у простейших (амебы, тетрахимена), у низших грибов (дрожжи), у высших растений в некоторых эмбриональных

тканях (эндосперм) и в зеленых частях, способных к фотореспирации.

У высших позвоночных животных они найдены главным образом в печени и почках.

пероксисомы часто локализуются вблизи мембран ЭПР. У зеленых растений пероксисомы часто находятся в тесном контакте с митохондриями и пластидами.

Впервые пероксисомы были выделены из печени и почек. Во фракциях пероксисом обнаруживаются ферменты, связанные с метаболиз­мом перекиси водорода. Это ферменты (оксидазы, уратоксидаза, оксидаза D-аминокислот) окислительного дезаминирования аминокислот при работе которых образуется перекись водорода (Н₂О₂) и каталаза, разрушающая ее. В пероксисомах печени каталаза составляет до |40% белков и локализована в матриксе. Так как Н₂О₂ является токсическим веществом для клеток, то каталаза пероксисом может играть защитную роль.

В пероксиомах происходит накопление специфических белков, которые синтезируются в цитозоле и имеют свои сигнальные участки. В мембране пероксисом есть рецепторныи белок, который узнает транспортируемые белки. Белки мембран пероксисом, как и липиды, приходят из цитозоля. Такое накопление содержимого и рост мембраны приводят к общему росту пероксисомы, которая затем с помощью неизвестного пока механизма делится на две, т.е. самореплицируется.

Рецепторная роль плазмалеммы

Мы уже встречались с этой особенностью плазматической мембра­ны при ознакомлении с ее транспортными функциями. Белки-пере­носчики и насосы являются кроме всего также рецепторами, узнаю­щими и взаимодействующими с определенными ионами. Рецепторные белки связываются с лигандами и участвуют в отборе молекул, по­ступающих в клетки.

В качестве таких рецепторов на поверхности клетки могут высту­пать белки мембраны или элементы гликокаликса — гликопротеиды. Такие чувствительные к отдельным веществам участки могут быть раз­бросаны по поверхности клетки или собраны в небольшие зоны.

Разные клетки животных организмов могут обладать разными на­борами рецепторов или же разной чувствительностью одного и того же рецептора.

"Диагностика неопухолевых заболеваний кишечника" - тут тоже много полезного для Вас.

Роль многих клеточных рецепторов заключается не только в связы­вании специфических веществ или способности реагировать на физи­ческие факторы, но и в передаче межклеточных сигналов с поверхно­сти внутрь клетки. В настоящее время хорошо изучена система переда­чи сигнала клеткам с помощью некоторых гормонов, в состав которых входят пептидные цепочки. Эти гормоны связываются со специфиче­скими рецепторами на поверхности плазматической мембраны клет­ки. Рецепторы после связи с гормоном активируют другой белок, ле­жащий уже в цитоплазматической части плазматической мембраны, — аденилатциклазу. Этот фермент синтезирует молекулу циклического АМФ из АТФ. Роль циклического АМФ (цАМФ) заключается в том, что он является вторичным мессенджером — активатором ферментов киназ, вызывающих модификации других белков-ферментов. Так, при действии на печеночную клетку гормона поджелудочной железы глю-кагона, вырабатываемого А-клетками островков Лангерганса, он свя­зывается со специфическим рецептором, что стимулирует активацию аденилатциклазы. Синтезированный цАМФ активирует протеинкина-зу А, которая в свою очередь активирует каскад ферментов, в конечном счете расщепляющих гликоген (запасной полисахарид животных) до глю­козы. Действие инсулина заключается в обратном: он стимулирует вхож­дение глюкозы в печеночные клетки и отложение ее в виде гликогена.

В целом цепь событий развертывается следующим образом: гормон взаимодействует специфически с рецепторной частью этой системы и, не проникая внутрь клетки, активирует аденилатциклазу, которая синтезирует цАМФ. Последний активирует или ингибирует внутрикле­точный фермент или группу ферментов. Таким образом, команда (сиг­нал от плазматической мембраны) передается внутрь клетки. Эффек­тивность этой аденилатциклазной системы очень высока. Так, взаимо­действие одной или нескольких молекул гормона может привести за счет синтеза множества молекул цАМФ к усилению сигнала в тысячи раз. В данном случае аденилатциклазная система служит преобразова­телем внешних сигналов.

Существует и другой путь, при котором используются другие вто­ричные мессенджеры, — это так называемый фосфатидилинозитольный путь. Под действием соответствующего сигнала (некоторые нерв­ные медиаторы и белки) активируется фермент фосфолипаза С, кото­рая расщепляет фосфолипид фосфатидилинозитолдифосфат, который входит в состав плазматической мембраны. Продукты гидролиза этого липида, с одной стороны, активируют протеинкиназу С, которая вы­зывает активацию каскада киназ, что приводит к определенным кле­точным реакциям, а с другой — приводит к освобождению ионов каль­ция, который регулирует целый ряд клеточных процессов.

Другой пример рецепторной активности — рецепторы ацетилхолина, важного нейромедиатора. Ацетилхолин, освобождаясь из нервного окончания, связывается с рецептором на мышечном волокне, что вы­зывает импульсное поступление Na⁺ в клетку (деполяризация мембра­ны), открывая сразу около 2000 ионных каналов в зоне нервно-мы­шечного окончания.

Разнообразие и специфичность наборов рецепторов на поверхно­сти клеток приводят к созданию очень сложной системы маркеров, позволяющих отличать свои клетки (той же особи или того же вида) от чужих. Сходные клетки вступают друг с другом во взаимодействия, приводящие к слипанию поверхностей (конъюгация у простейших и бактерий, образование тканевых клеточных комплексов). При этом клетки, отличающиеся набором детерминантных маркеров или не воспринимающие их, либо исключаются из такого взаимодействия, либо (у высших животных) уничтожаются в результате иммунологиче­ских реакций.

С плазматической мембраной связана локализация специфических рецепторов, реагирующих на физические факторы. Так, в плазматиче­ской мембране или в ее производных у фотосинтетических бактерий и синезеленых водорослей локализованы белки-рецепторы (хлорофиллы), взаимодействующие с квантами света. В плазматической мембра­не светочувствительных клеток животных расположена специальная система фоторецепторных белков (родопсин), с помощью которых световой сигнал превращается в химический, что в свою очередь при­водит к генерации электрического импульса.