Методы определения антител
Методы определения антител.
Процесс формирования антител (гуморальный иммунный ответ) у ВИЧ-инфицированных лиц тесно связан с основными стадиями развития заболевания, к которым относятся: первичное инфицирование, латентный период, персистентная генерализорванная лимфаденопатия (ПГЛ), СПИД-ассоцииированный комплекс и собсвенно СПИД. На каждом этапе развития ВИЧ-инфекции, характеризующимся определенными иммунопатологическими особенностями, серодиагностика должна рассматриваться как часть комплексной оценки состояния пациента, включающей, помимо клинического обследования, ряд лабораторных тестов. Составной частью
последних является определение в крови и других биологических жидкостях ВИЧ-антител и антигенов. Наиболее распространенным способом первичной серодиагностики ВИЧ-инфекции являются определение суммарных антител с помощью скринингоавые пробы отборочных тестов - ИФА и агглютинационных реакций. На втором (арбитражном) этапе используют более сложные современные тесты (Иммуноблот (ИБ), РИП), которые позволяют не только подтвердить, (или отклонить) первоначальное заключение, но и сделать это на уровне определения антител к индивидуальным белкам вируса.
Иммуно-ферментный анализ.
ИФА - является основным и наиболее широко применяемым методом определения антител к ВИЧ. В ИФА последовательно взаимодействует иммуносорбент, исследуемая сыворотка, конъюгат и хромоген. Инкубация каждого компонента с предыдущим завершается промывкой планшета для удаления несвязавшихся остатков очередного реагента. Итогом реакции является окрашивание содержимого лунок (обычно желто-оранжевое), интенсивность которого регистрируют на спектрофотометре с вертикальным прохождением луча по показателям оптической плотности. Особенностью применения ИФА в серодиагностике ВИЧ-инфекции являются частые ложноположительные результаты (ЛПР). Именно поэтому результат в ИФА не является основанием для заключения о ВИЧ-серопозитивности пациента. Причины ЛПР многобразны. Наиболее простые технические причины заключаются в нарушении правил постановки ИФА, а именно в несоблюдении режима промывочных процедур, фотозасвечивании при инкубации на свету после внесения хромогена. В этих случаях увеличивается интенсивность окрашивания жидкости в лунках. ЛПР могут провоцироваться после повторного замораживания и оттаивания, а также после прогревания. Однако в основе большей части ЛПР лежат процессы специфического взаимодействия белковых компонентов испытываемой сыворотки, не относящихся к ВИЧ-антителам, и антигена-иммуносорбента. Можно выделить следующие основные причины причины ЛПР при ВИЧ-инфекции:
Обратите внимание на лекцию "3.13 Эра милитаристов".
- недостаточная очистка иммуносорбента от балластных белков;
- спонтанное связывание антител сыворотки с пластиком, если его участки, не занятые иммуносорбентом, недостаточно блокированы или не блокированы совсем специальным нейтральным белком, например бычьим сывороточным альбумином;
- перекрестное взаимодействие с ВИЧ-белками иммуносорбента различных протеинов, присутствующих в крови лиц с определенными, чаще аутоиммунными патологическими процессами (рассеянный склероз, СКВ, лепра, туберкулез). К этой категории можно отнести ЛПР, связанные с частым донорством, инфекционны ми и онкозаболеваниями, ожогами, беременностью, повторными гемотрансфузиямия, пересадкой органов, тканей, а также лиц, находящихся на гемодиализе (6-8%);
- "эндемическое" происхождение ЛПР - образцы из регионов с определенной краевой патологией (малярия, висцеральный лейшманиоз), ведущей к структурной модификации сывороточных иммуноглобулинов, после которой они начинают взаимодействовать с белками ВИЧ;
- присутствие в крови ревматоидного фактора, часто провоцирующего ВИЧ-ЛПР. Ревматоидный фактор является мощным индуктором аутоиммунных процессов, сопровождающихся формированием антител с высокой степени гомологии к антигенным детерминантам некоторых белков ВИЧ, например gp 41. Кроме того, сам ВИЧ индуцирует аутоиммунные процессы. Из этого следует, что сыворотки ВИЧ-инфицированных больных и особенно больных СПИДом пациентов, положительные в ИФА, содержат, как правило, определенную долю ложноположительной активности, связанной с ВИЧ опосредованно;
- наличие в крови обследуемых людей антител к gag-белкам ВИЧ и прежде всего к белку P24. Это - одна из основных и наиболее значимых причин ЛПР в ИФА. Сыворотки, имеющие в ИБ антитела только к P24 (реже в сочетании с антителами к P17 и/или к P55) и не имеющие антител к основным диагностическим (поверхностным) белкам ВИЧ, составляют весьма часто встречающуюся и сложную для оценки категорию ЛПР-образцов. Существует ряд гипотез об их происхождении, в частности с наличием антител к экзо- или эндо- генным не идентифицированными еще ретровирусами. Вместе с тем анти-P24 синтезируются в обязательном порядке на ранних стадиях ВИЧ-сероконвенрсии. Поэтому практически обоснованным является иммунологическое наблюдение за лицами с антителами к gag-белкам ВИЧ, а также отстранение их от донорства.
