Инсулин

   Лекция № 4

   Тема: Инсулин. Получение инсулина на основе методов генетической инженерии

   План:

1. Открытие островков Лангерганса, инсулина, функции инсулина, природа инсулина.

2. Синтез инсулина в поджелудочной железе.

3. Генно-инженерный способ получения рекомбинантного инсулина.

Ключевые слова:  глюкагон, инсулин, сахарный диабет.

   Историческая справка.  В 1869 году в Берлине 22-летний студент-медик П.Лангерганс, изучая строение поджелудочной железы , обратил внимание на ранее не известные клетки, образующие группы, которые были равномерно распределены по всей железе. В последующем они были названы в честь него «островки Лангерганса».  В 1901 году было установлено, что сахарный диабет обусловлен разрушением этих «островков» в поджелудочной железе.

   Островки Лангерганса образованы α и β клетками, α- клетки вырабатывают гормон глюкагон, способствующий превращению гликогена печени в глюкозу крови, в результате чего увеличивается уровень сахара в крови, в β-клетках вырабатывается инсулин. Инсулин повышает проницаемость клеточных мембран для глюкозы, что способствует ее расщеплению тканями, отложению гликогена и уменьшению количества сахара в крови. При недостаточности функции поджелудочной железы развивается тяжелое заболевание – сахарный диабет.

Рекомендуемые материалы

   Первичная структура, т.е. точная последовательность расположения аминокислот, образующих молекулу инсулина впервые определена Фредериком Сэнгером (1949–1954 гг.).  В 1958 г. Ф. Сэнгеру была присуждена Нобелевская премия за работы по расшифровке структуры белков, особенно инсулина.  В последующем Д.Ходжкин методом рентгеновской дифракции определила пространственное строение молекулы инсулина (вторичную – четвертичную структуры).

   Первые препараты инсулина животного происхождения. С 1922 года свиной и бычий инсулин применялся как лечебный препарат при диабете. Технология заключалась в экстрагировании белка – инсулина из поджелудочной железы. При этом, для получения 100 грамм кристаллического инсулина необходимо было 800-1000 кг исходного сырья.

   По природе инсулин – небольшой глобулярный белок, содержащий 51 аминокислотный остаток и состоящий из двух полипептидных цепей, связанных между собой двумя дисульфидными мостиками.  Синтез инсулина в поджелудочной железе происходит следующим образом.  В клетках Лангерганса на рибосомах ЭПР  синтезируется  пептид-предшественник – препроинсулин. Он представляет собой полипептидную цепь, построенную из 110 аминокислотных остатков и включает в себя расположенные последовательно:  Сп-пептид – сигнальный пептид из 24 аминокислот, А-пептид из 21 аминокислотного остатка, С-пептид (соединительный) из 35 аминокислот и В-пептид из 30 аминокислотных остатков.

   Препроинсулин:   Сп -------А --------С--------В;

   После синтеза в ЭПР от этой молекулы отщепляется сигнальный (Сп) пептид – последовательность из 24 аминокислот, которые необходимы для прохождения синтезируемой молекулы через гидрофобную липидную мембрану ЭПР. Образуется  проинсулин, который транспортируется в комплекс Гольджи, где происходит частичный протеолиз – из молекулы проинсулина с помощью специфических эндопептидаз вырезается С-пептид – фрагмент из 35 аминокислот, обеспечивающий необходимую ориентацию А и В цепей и соединяющий их  дисульфидными связями.  В секреторных  гранулах инсулин, соединяясь с ионами цинка, образует кристаллические гексамерные агрегаты. Это белок из 51 аминокислотного остатка, состоит из двух полипептидных цепей А и В, связанных дисульфидными мостиками.  Таким образом, в β-клетках островков Лангерганса в результате процессинга из препроинсулина образуется проинсулин и затем инсулин.

   В настоящее время используются препараты человеческого инсулина, полученные генно-инженерной технологией при помощи рекомбинантных штаммов бактерий – E.coli и др.    Предварительно химическим путем раздельно синтезируются две нуклеотидные последовательности – кДНК, кодирующие А цепь и В цепь.  Затем эти последовательности нуклеотидов  встраиваются в LacZ ген E.coli, кодирующий часть молекулы фермента бета-галактозидазы,  LacZ ген находится в составе pBR322 плазмиды. Каждую из плазмид с LacZ геном и А или В цепью вводят в отдельный штамм   E.coli. В этих фрагментах кДНК нет нуклеотидных последовательностей, кодирующих сигнальные (Сп) и соединительные (С) пептиды.   Генетически модифицированные  E.coli раздельно культивируют в двух биореакторах, затем выделяют из культуральной жидкости химерные белки, состоящие из ковалентно связанных молекул рекомбинантного белка (А и В цепи) и собственного белка эшерихий. Выделив химерные белки, их обрабатывают бромцианом, разъединяющим белки по остаткам метионина. Далее А и В цепи отделяются от белков фермента бета-галактозидазы и очищаются. Очищенные А и В цепи  соединяются химическим путем дисульфидными связями и получают чистый, биологически активный мономер  инсулина.

   Инсулин стал первым препаратом, созданным с помощью технологии рекомбинантных ДНК. В настоящее время именно такой инсулин широко применяется в медицинской практике.

   Использованная литература:

1. Медицинская биотехнология. К.Х.Әлмағамбетов, Ә.Ө.Байдүйсенова. // Астана. – 2009. – 232с.

2. Основы биотехнологии. Т.А.Егорова, С.М.Клунова, Е.А.Живухина. // Москва. – «Академия». – 2008. – 208с.

3. Биотехнология. Н.В.Загоскина, Л.В.Назаренко и др. //  Москва. – «Оникс». – 2009. – 496с.

   Контрольные вопросы:

1. Физиология поджелудочной железы.

2. Гормоны поджелудочной железы.

3. Характеристика β-клеток  островков Лангерганса.

4. Функции инсулина,  глюкагона.

Рекомендация для Вас - 6 Метод контент-анализа.

5. Синтез инсулина в физиологических условиях в организме человека.

6. Открытия Ф.Сэнгера, Д.Ходжкин.

7. История производства ранних (первых) препаратов инсулина, применявшихся в лечении сахарного диабета.

8. Технология получения рекомбинантного инсулина.

9. Сахарный диабет І и ІІ  типов.  -  СРС.

10. Лекарственные формы инсулина, используемые в лечении сахарного диабета І типа.