Методы микробной трансформации

1.2.Методы микробной трансформации органических соединений.

Современная методология микробной химии существенно отлича­ется от подходов, традиционных для начального этапа развития этой науки. Наиболее распространенными ранее методами были трансформация растущей культурой или отмытыми клетками, на­ходящимися в определенной фазе развития. Конец 50—60-х го­дов ознаменовался появлением ряда новых подходов — была об­наружена и стала использоваться ферментативная активность спор грибов и актиномицетов, выполнены основные работы по при­менению непрерывного культивирования для трансформации ря­да органических соединений, разработаны основные принципы использования поврежденных в различной степени клеток (высу­шенные клетки, ацетоновые порошки и др.), прочно вошли в практику ферментные препараты. В настоящее время существуют несколько методов микробной трансформации органических соеди­нений:

I.   Использование ферментативных свойств интактных (нормальных) клеток:

1)   трансформация растущей культурой в периодических усло­виях;

2)   использование    ферментативной    активности    микробных культур, находящихся в определенных фазах развития;

 а)  транс­формация суспензиями неразмножающихся вегетативных клеток;

 б)  трансформация спорами;

 в)  непрерывные процессы;

3)  кометаболизм.

Рекомендуемые материалы

II.  Методы, основанные на дезорганизации обменных процес­сов клетки:

1)   применение в различной степени поврежденных и дезинте­грированных клеток;

2)   ингибирование определенных участков метаболических пу­тей;

3)   применение мутантов с блокированным синтезом опреде­ленных ферментов;

III.   Конструирование штаммов с повышенной   способностью к трансформации органических соединений.

IV.    Использование   фер­ментных   препаратов,   иммо­билизованных   ферментов   и клеток.

V.    Политрансформации.

1.2.1.Трансформация растущей культурой в периодических условиях

Это наиболее простой ме­тод, применяемый в тех слу­чаях, когда микробная трансформация представля­ет собой процесс, продукты которого не используются данной культурой. Транс­формируемый   субстрат   может вноситься в культуру, растущую, используя какой-либо дру­гой источник углерода, как, например, при окислении 3-метилпиридина до никотиновой кислоты нокардиями, растущими за счет использования глюко­зы. В других случаях рост может происходить при использовании части молекулы субстрата, который в данном случае является   и   ростовым,   и  трансформируемым,  например при окислении децилбензола до фенилуксусной кислоты. Ростовой частью в этом случае выступает алкильный заместитель (н-алкан) при бензольном кольце, который утилизируется микроорганизмами по схеме β-окисления жирных кислот. После прохождения 4 циклов β-окисления  остается  неусваиваемый  остаток – молекула фенилуксусной кислоты, которая и является целевым продуктом.

 

Если ростовой субстрат является одновременно и трансфор­мируемым, то максимумы скоростей ростового и трансформаци­онного процессов  совпадают. Поэтому воздействия, регулирую­щие рост клеточной культуры, соответственно влияют на накопление продукта транс­формации.

Если же ростовой и трансформируемый субстраты различны, то максимумы скоростей ростового и трансформационного про­цессов, как правило, сдвинуты во времени. Обычно наибольшая трансформирующая активность приходится на фазу замедления роста, когда скорость прироста биомассы начинает падать. Процесс трансформации может иметь место по окончании роста, т. е. когда максимальная удельная скорость трансформации соответствует стационарной фазе раз­вития культуры.

1.2.2.Трансформация суспензиями неразмножающихся клеток

Метод широко применяется в тех случаях, когда наибольшая активность трансформации приурочена к определенной фазе раз­вития культуры микроорганизма или если трансформируемый субстрат может разлагаться культурой до конечных продуктов, а процесс метаболизма необходимо остановить на определенном этапе.

Метод сравнительно легко применим в тех случаях, когда трансформация осуществляется грибными культурами, мицелий которых возможно без особых затруднений отделить от среды вы­ращивания в нужный момент и ресуспендировать в буферном растворе или водопроводной воде, где и осуществляется транс­формационная реакция. Метод трансформации суспензиями неразмножающихся клеток позволяет использовать культуру опре­деленного физиологического состояния. Так, 11-гидроксилирование кортексолона с помощью Tieghemella orchldis 233 наиболее интенсивно осуществляется 19-часовым мицелием.

Трансформация ацетата кортизона в кортизон (гидролиз) Actinomyces corymbosus наиболее активно осуществляется 24-часовой куль­турой мицелия в период ее перехода в стационарную фазу.

1.2.3.Трансформация осуществляемая спорами грибов и актиномицетов

Трансформация   органических   веществ спорами   имеет   ряд особенностей, представляющих интерес в связи с практическим исполь­зованием. Эти процессы обычно осуществляются в простых сре­дах — дистиллированной    или    водопроводной    воде,   буферных растворах.  Иногда для  этого требуются добавки  органических веществ в небольших концентрациях. Споры активны после дли­тельного  хранения   (до  трех  лет  в  замороженном   состоянии). Если процесс трансформации идет в бедной среде, то споры мо­гут быть  отмыты  и  использованы  еще 4-5  раз.  Оптимум  рН обычно выражен менее четко, чем у вегетативных клеток.  Это позволяет  использовать условия,  предотвращающие заражение посторонними микроорганизмами. Подобные наблюдения стиму­лировали попытки применения трансформации с использованием спор в промышленных масштабах. Такая возможность продемон­стрирована   на   следующих   процессах:    11а-гидроксилирования прогестерона   и   кортексолона   спорами   Aspergillus   ochraceus; 1-дегидрогенизации   кортексолона   спорами   Septomyxa   affinis; 1la-гидроксилирования  6а-,   16а-,   17а-диоксипрегн-4-ендиона в нестерильном 200-литровом ферменте. В последние годы осуществлен гидролиз феноксиметилпенициллина спорами Fusarium sp. Конидии Aspergillus candidus NRRL 305 синтезировали, манит из глюкозы с 75%-ным выходом. Появились работы по иммобилизации спор в полиакриламидный гель, что дает возможность применения непрерывно действующих колонок. Таким образом, были осуществлены гидролиз сахарозы и многочисленные трансформации стероидов.

1.2.4.Непрерывные методы культивирования

Преимущество   непрерывного   культивирования   по   сравне­нию с периодическим при получении биомассы клеток стимули­ровали   его   применение   для   синтеза   микробных   метаболитов. Процессы   получения   продуктов,   непосредственно   связанные   с ростом микроорганизмов, в условиях непрерывного культивиро­вания осуществляются сравнительно легко. Образование микроб­ных метаболитов, не связанное с ростом, потребовало больших усилий для реализации процессов непрерывным методом, и хотя многие из них осуществлены в лаборатории, внедрение этого ме­тода   в   практику   сопряжено   с   рядом   затруднений.   Одним   из недостатков непрерывного метода, имеющим существенное значе­ние, является то, что в периодической культуре легче получить максимальный выход продукта на единицу субстрата, в то время как в проточной культуре часть субстрата обычно не превраща­ется.  Однако более детальное и  углубленное  исследование не­прерывной трансформации сорбита в сорбозу культурой Acetobacter suboxydans, прогестерона в   11α-оксипрогестерон культу­рой  Aspergillus  ochraceus,   прегнандиена   в   прегнатриен   с   по­мощью Septomyxa affinis и т. д. наглядно продемонстрировали рентабель-ность и преимущества этого метода.

Непрерывные методы микробной трансформации получили интенсивное развитие благодаря разработке метода иммобили­зации спор, клеток и ферментов.

1.2.5.Кометаболизм

Кометаболизм — процессы трансформации или полного раз­ложения органических соединений, осуществляемые микроорга­низмами сопряженно с метаболизмом других субстратов – косубстратов, которые не являются ростовыми. Так, упомянутое выше окисление нокардиями п-ксилола или 3-метилпиридина в соответствующие кислоты без косубстратов на питательной среде, содержащей  такие соединения, как глюкоза и ацетат, происходит медленно. В присутствии же ксилозы или глицерина активность трансформации резко возрастает. Важно отметить, что глюкоза и ацетат являются оптимальными ростовыми субстратами для культур, осуществляющих описываемые процессы, в то время как ксилоза лишь частично окисляется, но не используется ими в качестве источника углерода, а глицерин поддерживает лишь медленный рост. Таким образом,оптималь­ные ростовые субстраты - глюкоза и ацетат- не стимулируют трансформацию и, следовательно, не являются косубстратами.

При использовании метода растущих культур накопление про­дуктов трансформации на средах с глюкозой и ацетатом, но без косубстратов, про­исходит лишь в связи со значительным увеличением массы кле­ток в культуре, которые имеют низкую удельную активность. В вариантах же с глицерином или ксилозой даже при медленном росте или в его отсутствие удельная активность трансформации значительно выше, что и стимулирует значительное накопление продуктов даже при низкой плотности клеточной культуры. Такие процессы и называют кометаболизмом; он обнаруживается при сравнении удельных скоростей про­цессов трансформации на различных средах.

Механизм сопряжения между трансформацией и метаболиз­мом косубстрата, приводящего к интенсификации первого про­цесса, изучены слабо. По всей вероятности такое сопряжение заключается в использовании в первом процессе каких-то мета­болитов, образующихся во втором процессе и обеспечивающих первый энергией и (или) кофакторами. Поэтому кометаболизм играет важную роль в тех случаях, когда в метаболической сис­теме микроорганизма отсутствует или недостаточно совершенна координация метаболических путей. Именно поэтому условия кометаболизма бывают, необходимы микроорганизму для превращения необычных для  него субстратов   (например,  упомянутых выше п-ксилола и 3-метилпиридина).

Поскольку косубстрат играет в процессе кометаболизма спе­цифическую и вполне определенную роль, правильный его выбор имеет важнейшее значение. В некоторых случаях, когда фермен­тативный механизм трансформации известен, выбор косубстрата не составляет труда. Так, для интенсификации процесса восста­новления карвона в дигидрокарвон культурой Pseudomonas ovalis в качестве косубстрата был выбран этанол потому, что данный микроорганизм имеет активную НАД-зависимую алкогольдегидрогеназу, окисляющую этанол в ацетальдегид; последняя обеспечивает трансформацию карвона восстанови­тельными эквивалентами (НАД*H):

  C₂H₅OH  +   HAD   -----   CH₃COH  +  НАД*H

В случаях, когда механизм процесса неясен, косубстраты приходится подбирать путем проверки разных соединений. Окис­лительные процессы кометаболизма иногда называют соокислением (под таким названием они были описаны впервые амери­канским микробиологом Фостером), восстановительные — совосстановлением.

1.2.6.Применение поврежденных и дезинтегрированных клеток

Для получения метаболита, не накапливающегося в среде в обычных условиях в заметных количествах, часто требуются особые приемы радикального воздействия на клетки. Сущность этих приемов заключается в «дезорганизации» нормально функ­ционирующих ферментных систем клетки с целью вычленения их отдельных участков. Одним из способов такой дезорганизации является повреждение в той или иной степени клеток микроорга­низмов, от простого высушивания до глубокой дезинтеграции клеточных структур. Примером может служить превращение 5'-уридинмонофосфорной кислоты (УМ) в уридиндифосфат-N-ацетилглюкоз-амин (УДФАГ) под действием препарата сухих дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Процесс идет в фосфатном буферном растворе (рН 7,6 с глюкозамином, фруктозой и MgCL₂). Через 10 ч инкубации выход УДФАГ составляет 66 % от исход­ного УМФ. Интактные дрожжи трансформирующей активностью не обладают. Когда высушивание не достигает цели, применяют другой способ дезорганизации клеточного метаболизма. Приме­ром может служить превращение аденозинмонофосфата (АМФ) в аденозинтрифосфат (АТФ) ацетоновым порошком или механи­чески растертыми клетками дрожжей.

1.2.7.Ингибирование определенных участков метаболитических путей.

Если положение фермента, ответственного за микробную трансформацию, в общей системе обмена веществ установлено, то во многих случаях есть возможность вычленить реакцию, осу­ществляемую этим ферментом, специфически ингибируя следую­щий фермент. Так, деградация продуктов первичного окисления н-алканов (β-окисление жирных кислот) может быть остановлена с помощью специфического ингибитора — акриловой кислоты. В этих условиях углеводороды окисляются в алкановые кислоты   и   кетоны.  Внесение  в  растущую  культуру  Nocardia  sp.   KCN

(l-10~³ M) ингибирует катаболизм прогестерона культурой до конечных продуктов. В качестве основного продукта получают 9α-оксипрогестерон:

1.2.8.Применение мутантов с блокированным синтезом определенных ферментов

Этот метод аналогичен предыдущему, только вместо ингиби­торов в этом случае применяют генетические методы — получе­ние мутантов с блокированным синтезом определенных фермен­тов. Так, из штамма Candida cloaceae, окисляющего парафины, был получен мутант М-1, не способный далее ассимилировать дикарбоновые кислоты, и накапливающий при использовании гексадекана до 22 г/л тетра-декандикарбоновой кислоты. Затем был получен штамм MR-12,вообще не способный расти на средах с н-алканами и нуждающийся в других субстратах (ацетат). Отмытые клетки этого штамма накапливают около 4,3 г/л тетрадекановой кис­лоты из чистого гексадекана, а при росте на среде гексадекана с ацетатом — до 61 г/л. В данном случае путем получения мутанта удалось вы­членить функцию начального этапа катаболизма н-алканов (не более трех ферментов) и использовать их активность для окисления этих углеводородов в дикарбоновые кислоты.

1.2.9. Конструирование штаммов с повышенной способностью к трансформации

Изучение нехромосомных элементов наследственности, конт­ролирующих катаболизм у микроорганизмов многих органиче­ских веществ («плазмиды биодеградации»), навело на мысль об использовании их для создания «улучшенных» штаммов, транс­формирующих органические соединения. Принципиальная воз­можность этого подхода показана на примере  окисле­ния нафталина в салициловую кислоту.

Процесс получения салициловой кислоты из нафталина с помощью бактерий рода Pseudomonas был описан достаточно давно. Недостатком исходных штаммов было то, что салициловая кислота после крат­ковременного накопления в среде потребляется культурой в каче­стве источника углерода, что значительно снижает производительность про­цесса. Штамм Ps. putida 41, полученный методом конъюгации в результате переноса плазмиды NPL-1, контролирующей первич­ный этап окисления нафталина до салициловой кислоты, от донорного штамма Ps. puti­da 12А к реципиенту Ps. putida 4, не обладающему способностью окислять нафталин до салициловой кислоты, накапливал салици­ловую кислоту без ее дальнейшего потребления и отличался от донорного штамма значительно более высокой производительно­стью. В присутствии анионообменной смолы Амберлит IR-45, связывающей образующийся салицилат, в ферментационной среде выход продукта, равный 90 %, достигал­ся за 10 ч ферментации.

1.2.10.Ферментные препараты и иммобилизованные ферменты

Применение очищенных препаратов — логически наиболее естественный способ практического использования активности отдельных ферментов микробных клеток для трансформации органических веществ. Однако технически этот подход реализуем лишь в том случае, если ферментные препараты могут быть получены сравнительно легко, если ферменты стабильны и не тре­буют кофакторов и т. д.

Особенно широкие перспективы в использовании ферментов для синтеза различных соединений открываются в связи с разра­боткой методов их иммобилизации. Основные достоинства иммо­билизованных ферментов — возможность неоднократного исполь­зования, отсутствие необходимости очистки продукта от катали­затора, стабильность при хранении и в процессе использования, возможность вести реакцию в более широком диапазоне физико-химических условий, в непрерывных условиях и т. д. Реализация большого числа процессов трансформации углеводов, стероидов, антибиотиков, аминокислот с помощью иммобилизованных фер­ментов убедила в экономической перспективности этого метода. Кроме названных выше процессов, имеющих промышленное применение, представляет интерес получение L-аспарагиновой кислоты из фумарата аммония с помощью иммобилизованной в полиакриламидный гель аспартазы Escherichia coli. Фермент работает непрерывно длительное время (до 8 дней), не снижая активности, и количественно превращает субстрат при концент­рации фумарата 0,2 М и скорости протока 0,16 ч^-1. Сравнение с процессами, в которых участвовала растворимая форма фер­мента или интактные клетки Е.coli, показало экономическую целесообразность использования иммобилизованной  аспартазы.

1.2.11.Иммобилизация клеток

Наряду  с  успешной   иммобилизацией  многих   ферментов   и применением   этого   метода   в   промышленности   исследователи столкнулись с рядом трудностей, характерных для работы с фер­ментами, зависимыми от кофакторов,  а также в тех случаях, когда трансформации осуществляются несколькими ферментами. Были предприняты попытки использовать активность «сложных» ферментов и ферментных комплексов путем иммобилизации кле­ток. Иммобилизация клеток позволяет эксплуатировать отдель­ные  ферменты,  а  также  их  системы,  что  затруднительно  при работе с иммобилизованными ферментами. Обмен иммобилизо­ванных клеток отличается от метаболизма интактных микроорга­низмов, что может быть использовано в целях регуляции транс­формации. Эффективность процессов, осуществляемых иммоби­лизованными клетками, в ряде случаев выше их эффективности, как у свободных микроорганизмов, так и у иммобилизованных ферментов. Для иммобилизации клеток используются почти все методы, применяемые для иммобилизации ферментов, но наибо­лее распространенным в настоящее время является включение в полиакриламидный (ПААГ) и каррагенановый гели.

 Получение аминокислот и органических кислот с использо­ванием клеток, иммобилизованных в полиакриламидный и карра­генановый гели — один из примеров, демонстрирующих возмож­ности и перспективы метода. Клетки Е. coli, иммобилизованные в ПААГ, осуществляли превращение фумаровой кислоты в аспарагиновую. При этом активность иммо-билизованных клеток сохранялась при 37°С в присутствии ионов Mg⁺⁺ в течение 40 сут. при скорости прото­ка 0,5 мл/ч через колонку размером 10х100 см, причем выход аспартата достигал 95 %. Процесс был успешно применен в промыш­ленном масштабе. Ежесуточный выход кислоты при использова­нии промышленной колонки 1900 кг или 57,6 т/мес, время полу­жизни и активность клеток свыше 120 сут. Позже был разрабо­тан более экономичный способ иммобилизации клеток в карра­генан. Продуктивность иммобилизованных в каррагенан клеток в 15 раз превышала таковую для иммобилизованных в ПААГ, вре­мя полужизни их также увеличилось до 2 лет. Преимущества метода были так велики перед существовавшим ранее, что фирма “Танабе” в 1979 г. заменила им промышленное получение L-acnaрагиновой кислоты. Такой же процесс был осуществлен в Советском Союзе.

Получение L-яблочной кислоты из фумаровой с помощью иммобилизованных в каррагенан клеток Brevibacterium [iuvum — второй пример промышленного использования ферментативной активности микроорганизмов для биоконверсии органических соединений.

Пристального внимания заслуживает и метод иммобилизации смешанных культур. Так, осуществлена трансформация сорбозы в 2-кето-L-гулоновую кислоту смесью иммобилизованных в ПААГ клеток Gluconobacter melanogenus IFO 3293 и Pseudomonas syringae NRRL B-865. Первая бактерия окисляла сорбозу в сорбозон, а вторая, обладая активной сорбозоноксидазой, обра­зовывала 2-кето-L-гулоновую кислоту.

1.2.12.Политрансформации

Трансформация сложных органических молекул часто предпо­лагает более чем одну ферментативную реакцию. В ряде случаев для получения практически ценных продуктов требуются весьма существенные перестройки молекулы субстрата, которые могут включать различные процессы, например окисление и гидролиз или окисление, восстановление и гидролиз и т. д. Эти задачи могут быть решены разными путями.

1.Подбор штамма, способного осуществлять нужную трансформацию

10 - Взаимосвязь конфликтных ситуаций - лекция, которая пользуется популярностью у тех, кто читал эту лекцию.

полностью. Так, Mycobacterium mucosum 77 в присут­ствии ингибитора расщепления кольцевой структуры осуществляет трансформацию 17а-метил ∆⁵-андростендиол-3β, 17β в дианабол:

Процесс, таким образом, заключается в окислении гидроксила, изомеризации ∆⁵ → ∆⁴ и 1-дегидрогенизации.

В Советском Союзе был разработан опытно-промышленный регла­мент получения преднизолона из гидрокортизона иммобилизован­ными в полиакриламидный гель клетками Arthrobacter globifor­mis.

2. Использование нескольких последовательных микроб­ных трансформаций. Показательным примером такого рода про­цессов может служить трансформация боратного комплекса 16-а-оксикортексолона. Первая стадия—11-а-гидроксилирование — наиболее эффективно осуществляется мицелием Aspergllus ochraceus в неростовых условиях. Через 24 ч вносится ацето­новый порошок клеток Arthrobacter simplex и за несколько часов происходит 1-дегидрогенизация. Выход почти количест­венный.

3. Использование смешанных культур. В большинстве случа­ев метод применяется для трансформации стероидов, например для 1-дегидрогениза-ции и дезацетилирования. Эти процессы дают возможность получить преднизон из ацетата кортизона в одну стадию. Смешанные культуры в некоторых случаях более эффективны, чем последовательно использованные монокультуры. Сравнение ферментативных активностей Arthrobacter globiformis и Mycobacferium album в монокультуре и в смеси показало, что дезацетилирующая активность М. album в присутствии A. globifor­mis повышается.