Морфология и физиология бактерий

Лекция №2

МОРФОЛОГИЯ   И   ФИЗИОЛОГИЯ БАКТЕРИЙ,

ГРИБОВ, ПРОСТЕЙШИХ.

Световой микроскоп с иммерсионной системой

Для изучения микробов в микроскопе требуется увеличение примерно в 1000 раз. Поэтому используется микроскопы с иммерсионной системой ("иммерсио" – погружение) В состав иммерсионной системы входит иммерсионный объектив (х⁹⁰) и иммерсионное масло, которым заполняют разрыв между изучаемый предметом и передней линзой иммерсионного объектива. Поскольку показатели преломления стекла и масла близки, это позволяет избежать потери световых лучей вследствие их отклонения, и, тем самым, создать оптимальную освещённость поля зрения. Необходимость в концентрации светового пучка обусловлена также и чрезвычайно малым диаметром передней линзы иммерсионного объектива. При микроскопировании необходимо помнить, что объективы "сухой системы" не предназначены для погружения в масло, которое может привести их в негодность. Микроскопия с иммерсионной системой позволяет изучать убитые микробы в окрашенном состоянии (их форму, размеры, взаимное расположение, строение бактериальной клетки) и дифференцировать одни микробы от других.

Способность микробов окрашиваться различными методами называют тинкториальными свойствами.

В некоторых случаях (изучение морфологии грибов, простейших, других относительно крупных объектов в живом неокрашенном состоянии) используется световой микроскоп с затемнённым полем зрения (объективы х⁴⁰ или х⁸) Для микроскопии готовят препараты "раздавленная капля" или "висячая капля".

Измерение микробов.

Рекомендуемые материалы

Изучение морфологических признаков микробов  (длина, ширина, форма) нередко проводят для определения их вида. Размеры клеточных микроорганизмов варьируют от долей микрометра  (мкм, 10^-6м) до нескольких десятков микрометров. Мелкие клетки бактерий имеют размеры 1-2, крупные от 8 до 12 мкм и более. Для измерений используют окуляр-микрометр (встроенную в окуляр прозрачную линейку).

Темнопольный микроскоп (ультрамикроскоп)

Особенностью этого микроскопа является наличие конденсора темного поля (параболоид-конденсатора), который концентрирует световой пучок и направляет его на исследуемый объект сбоку. Ввиду того, что прямые лучи отсекаются центральной диафрагмой конденсора, а косые лучи, выходящие по периферии диафрагмы, не попадают в объектив, ультрамикроскоп тлеет темное поле зрения. При освещении косыми лучами живых и неживых частиц, в т.ч. микробов, часть отраженных лучей попадает в объектив; при этом наблюдается яркое свечение частиц на темном фоне. Темнопольную микроскопию используют для изучения подвижности микробов, наблюдения очень тонких объектов (спирохет) в препарате "раздавленная капля".

Фазово-контрастный микроскоп

Эта разновидность светового микроскопа позволяет изучать структуру живых неокрашенных микробов (прозрачных объектов). При прохождении света через неокрашенные микробные клетки, в отличии от окрашенных, амплитуда световых волн не меняется, а происходит лишь их изменение по фазе, что не улавливается глазом человека. Сдвиг по фазе происходит при прохождении участков с большей оптической плотностью (рибосомы, нуклеоид). Специальные приспособления: фазовый конденсор и объективы с фазовыми кольцами позволяют преобразовать невидимые фазовые изменения в видимые амплитудные.

Люминесцентный микроскоп

Принцип работы этого микроскопа основан на явлении люминесценции. Для получения изображения объектов их обрабатывают флюорохромами, которые при возбуждающем облучении коротковолновой частью спектра светятся цветами с большей длиной волны (зеленым, оранжевым и др.). В люминесцентном микроскопе изучают как живые, так и убитые микробы  (с "сухой" или иммерсионной системами). Люминесцентная микроскопия позволяет получить контрастное цветное изображение, обнаружить малое количество микробов, изучить их структуру и химический состав, использовать метод иммунофлюоресценции.

Электронный микроскоп

Этот прибор отличается от световых микроскопов значительно большей разрешающей способностью  (около 0,001 мкм) за счет использования вместо света пучка электронов, а вместо стеклянных оптических - электромагнитных линз.  В электронном микроскопе изучают вирусы, ультраструктуру убитых макроорганизмов.

Приготовление препарата для микроскопического исследования

Окраска по Граму.

I этап - приготовление мазка.

Предметное стекло обжигают в пламени газовой горелки. Восковым карандашом отмечают пределы будущего мазка в виде окружности диаметром 1-2 см. и кладут стекло на стол. Прокаленной петлёй наносят в середину кружка небольшую каплю стерильного изотонического раствора хлорида натрия  (ИХН). Затем в эту каплю вносят небольшое количество культуры бактерий, тщательно эмульгируют и распределяют тонким слоем в пределах кружка. Мазки из бульонных культур готовят без предварительного нанесения ИХН.

2 этап - высушивание.

Стекло оставляют на воздухе до исчезновения влаги.

3 этап - фиксация.

Фиксацию проводят для того, чтобы убить микробы, прикрепить их к стеклу, повысить их восприимчивость к красителям. Для фиксации предметное стекло  (мазком вверх) трижды накладывают на пламя горелки на 2-3 секунды с интервалом 4-6 секунд. Мазки из гноя, крови, мокроты, отечной жидкости фиксируют погружением в фиксирующие жидкости (ацетон, смесь Никифорова). Такая фиксация позволяет избежать грубых деформаций объекта исследования.

4 этап - окраска.

Различают простые и сложные  (дифференцирующие) способы окраски. Простые способы позволяют судить о величине, форме, локализации и взаимном расположении клеток. Сложные способы позволяют установить структуру микробов и часто их неодинаковое отношение к красителям. Примером простых способов может служить окраска фуксином (1-2 минуты), метиленовым синим или кристалл-виолетом (3-5 минут), а сложных -окраска по Граму, Романовскому-Гимзе, Циль-Нильсену.

Дифференцирующий метод Грама.

После окраски этим методом одни бактерии, окрашиваются в темно-фиолетовый цвет  (грамположительные, Гр+), другие - в бордово-красный (грамотрицательные, Гр-). Сущность этого способа окраски состоит в том, что Гр+ бактерии прочно фиксируют комплекс из генцианвиолета и йода, не обесцвечиваясь этанолом. Гр- бактерии после обесцвечивания докрашивают фуксином.

Схема окраски бактерий по Граму:

                                                       

После высушивания мазки готовы для микроскопии.

Основные формы бактерий

Структура бактериальной клетки. Обязательные (постоянные) структурные элементы

Обязательными структурными элементами бактерий являются: цитоплазма с нуклеоидом и рибосомами, цитоплазматическая мембрана  (ЦПМ), клеточная стенка.

Цитоплазма прокариотов в отличие от эукариотов не содержит митохондрий и хлоропластов, аппарата Гольджи, лизосом, эндоплазматической сети. Нуклеоид выполняет в клетке бактерий функцию ядра, т.е. является носителем генетической информации, однако, в отличие от ядра эукариотической клетки, он не имеет ядерной мембраны, не делится митозом. Нуклеоид состоит из замкнутой в кольцо нити ДНК. В генетическом отношении ДНК нуклеоида является единственной бактериальной хромосомой. В связи с этим бактерии имеют гаплоидный набор генов, контролирующих все их жизненно важные функции. Органеллы цитоплазмы выявляются при электронной микроскопии.

Цитоплазматическая мембрана ограничивает снаружи цитоплазму и состоит из тонкого слоя фосфолипидов и белка. Функции ЦПМ: получение энергии в результате биологического окисления, участие в питании посредством активного транспорта веществ, участие в биосинтезе веществ, делении клетки. В состав ЦПМ входят окислительные ферменты, пермеазы, различные биосинтетические ферменты. ЦПМ выявляют при электронной микроскопии.

Клеточная стенка у Гр+ бактерии, как правило, содержит многослойный пептидокликан, который придает клеточной стенке прочность.

Клеточная стенка определяет форму бактерий, служит для механической защиты, участвует в питании за счет диффузии и осмоса. У Гр- бактерий клеточная стенка представлена тонким слоем пептидогликана, покрытого наружной мембраной, в состав которой входят белки, фосфолипиды и липополисахариды (ЛПС). Наружная мембрана клеточной стенки патогенных микробов во многом определяет специфичность их взаимодействия с организмом хозяина и помогает в распознавании близкородственных микробов. По компонентам и структуре клеточной стенки, биохимическим механизмам ее синтеза бактерии коренным образом отличаются от животных и растений. Поэтому лекарственные препараты, специфически воздействующие, например, на бактериальные стенки, безвредны для высших организмов. Клеточную стенку бактерий выявляют при электронной микроскопии, специальным окрашиванием или в опыте плазмолиза.

Необязательные  (непостоянные) структурные элементы.

К ним относят:   капсулу, спору, включения, жгутики, пили.

Капсула представляет собой поверхностно расположенное слизистое образование, которое по химической природе чаще является полисахаридом. Капсула выполняет защитную функцию, предохраняя клетку во внешней среде от высыхания и других неблагоприятных факторов, а в организме хозяина - от фагоцитоза, бактериолизиса и других реакций, лекарственных препаратов. Бактерии, образующие капсулу в организме и на питательных средах, называют капсульными (например, клебсиеллы пневмонии). Некоторые бактерии образуют макрокапсулу только в организме  (золотистый стафилококк, стрептококк пневмонии, палочка сибирской язвы, возбудитель чумы, туляремии и др.). Многие бактерии образуют микрокапсулу: возбудитель коклюша, патогенные энтеробактерии и др. Капсулу выявляют методом Бурри-Гинса: бактерии смешивают с каплей туши, распределяют их по стеклу виде тонкого мазка и фиксируют. После окрашивания разведенным карболовым фуксином в световом микроскопе на серо-коричневом (тушевом) фоне препарата видны красные тела бактерий, окруженные бесцветными зонами капсул.

Споры являются формой существования, предназначенной для сохранения бактерий во внешней среде. В одной бактериальной клетке в течение 12-18 часов формируется 1 спора, которая при благоприятных условиях за 4-6 часов прорастает в 1 вегетативную клетку. Спорообразующими являются, как правило, Гр+ палочковидные бактерии: те, у которых диаметр споры не превышает поперечный размер клетки, называют бациллами, те, у которых диаметр больше - клостридиями. Устойчивость спор к неблагоприятным физико-химическим воздействиям связана с наличием многослойной оболочки, повышенным содержанием липидов, ионов кальция, магния, вода в связанном состоянии. Жизнеспособность спор при обычных условиях может сохраняться в течение десятилетий и столетий. Для уничтожения спор применяют методы стерилизации (пар под давлением, горячий воздух и др.). Споры окрашиваются плохо. Для выявления используют сложные методы окраски (по Циль-Нильсону, Ожешке и др.)

Включения. В клетках прокариотов можно обнаружить включения (скопления полисахаридов, липидов, полифосфатов, серы). У дифтерийной палочки и некоторых других бактерий в цитоплазме обнаруживаются зёрна волютина  (полифосфаты), выполняющие функцию запасного вещества  (источника фосфора и энергии). Включения и цитоплазма по-разному окрашиваются одними и теми же красителями. Например, при окраске уксусно-кислым генцианвиолетом цитоплазма у дифтерийной палочки окрашивается в бледно-фиолетовый цвет, а расположенные по полюсам зерна волютина - в темно-фиолетовый. Обнаружение зёрен волютина имеет диагностическое значение.

Жгутики - являются поверхностными придатками бактериальной клетки, состоят из белка флагеллина и выполняет функцию движения. Наиболее подвижки микробы с 1 жгутиком - монотрихи (холерный вибрион) менее подвижны микробы с пучком жгутиков на одном из полюсов –лофотрихи (синегнойная палочка) или имеющие жгутики на обоих полюсах - амфитрихи; наименее подвижны перитрихи, у которых жгутики расположены по бокам или по, всей поверхности (многие энтеробактерии). В световом микроскопе жгутики не видны. Для их выявления используют прямые методы: электронную микроскопию или специальное окрашивание, позволяющие увеличить размеры жгутиков, например, за счет наслоения солей тяжелых металлов. С целью косвенного выявления жгутиков изучают подвижность микробных клеток. Для этого готовят нативные препараты (раздавленная или висячая капля), которые микроскопируют в затемненном поле зрения, темнопольном или фазовоконтрастном микроскопах.

Пили также являются поверхностными придатками бактериальной клетки и представляют собой тончайшие нити (тоньше и короче жгутиков), состоят из белка пилина. Функцией пилей являются прикрепление к субстрату; они также способствуют контакту клетки – донора с клеткой - реципиентом при конъюгации. Наличие пилей у патогенных микробов во многом определяет их способность вызывать заболевание, т.к. они необходимы для осуществления адгезии (прилипания). Прямое выявление пилей возможно только при электронной микроскопии.

Химический состав   бактериальной клетки.

(свободная и связанная), нуклеиновые кислоты ДНК и РНК), белки, углеводы, липиды и минеральные соли. Свободная вода, являясь универсальной дисперсионной средой, участвует в метаболизме, связанная вода - определяет устойчивость клетки к физическим факторам. Нуклеиновые кислоты являются носителями наследственной информации. Белки входят в состав различных структур бактериальной клетки, являются составной частью ферментов, токсинов, антигенов, определяют отношение к красителям, лекарственным и дезинфицирующим веществам. Углеводы являются источником энергии, и, наряду с белками, могут определять специфичность бактерий. Липиды определяют заряд клетки и проницаемость мембран, устойчивость к кислотам, щелочам, спиртам, а также токсичность микроба.

Грибы - это одноклеточные или многоклеточные эукариоты без хлорофилла, но близкие к растениям. Патогенные для человека грибы имеют следующие морфологические формы:

1 - гифы (нити), которые при сплетении образуют мицелий (тело гриба).

Различают:

а) истинный (у плесеней) - трубка, разделённая или неразделённая перегородками (септами), покрытая общей оболочкой;

б) ложный (псевдомицелиий, у грибов рода Кандида - Candida) вытянутые, нитевидные клетки, каждая из которых имеет свою оболочкy.

2 - круглые и овальные почкующие клетки (у дрожжей и грибов рода Кандида). Размеры вегетативных форм – х1 – х100 мкм. Структура их сложная: многослойная клеточная стенка, цитомембрана, дифференцированное ядро, полисомы, митохондрии, включения, пигменты.

3 - споры (пo назначению и свойствам они отличаются от спор бактерий: у грибов это форма размножения и распространения; споры гриба менее устойчивы к высокой температуре).

Различают:

а) эндоспоры, покрытые оболочкой. Например, аски у дрожжей, образующиеся в результате полового размножения;

б) экзоспоры; контактируют с воздухом. Например, микроконидии у гриба Пенициллюм (Penicillium).

Способы размножения грибов:

1 - поперечное деление;

2 - фрагментация;

3 - почкование;

4 - спорообразование;

5 - половой способ.

По типу дыхания грибы - аэробы и факультативные анаэробы, по типу питания - гетеротрофы. Для выращивания грибов применяют среду Сабуро  (дрожжевой экстракт + глюкоза + пептон + агар-агар) рН=6,8

Сроки роста - от 2-3 дней до месяца. Характер колоний различен: беловато-желтые, напоминающие капли сметаны, пушистые, морщинистые, гипсовидно-мучнистые, кожистые, с различными бороздками, пигментами. По отношению к питательной среде различают мицелий:

воздушный (репродуцирующий), на концах которого располагаются споры, и субстратный, врастающий в питательную среду.

Среди патогенных грибов известны двухфазные грибы. Это грибы разной морфологии в зависимости от локализации: в организме человека это обычно дрожжевая форма, а на среде Сабуро - мицелиальная. К ним относятся возбудители особо опасных микозов: гистоплазмоза, кокцидиоидного микоза и других заболеваний.

Токсинообразование: большинство грибов образуют эндотоксин, некоторые - экзотоксин. Грибы подразделяют на две группы.

1. Низшие грибы. Для медицины и фармации важны 2 класса:

- зигомицеты (вызывают болезни лекарственных растений);

- оомицеты (например, мукоровая плесень   - вызывает мукоз у людей

и животных).

2. Высшие грибы. Представляют интерес 2 класса:

- совершенные грибы - аскомицеты (наиболее характерен половой способ размножения);

а) плесени

б) дрожжи

в) возбудитель гистоплазмоза

- несовершенные грибы - дейтеромицеты (половой способ менее характерен):

а) грибы рода Кандида

б) возбудители дерматомикозов (поражают кожу и ее придатки - волосы, ногти). Значение грибов:

1. Патогенные грибы вызывают у человека микозы.

2. Грибы широко используются в биотехнологии: как продуценты антибиотиков (Пенициллюм), белков, полисахаридов, витаминов, ферментов; в пищевой промышленности (хлебопечение, сыроварение, изготовление кисломолочных продуктов)

3. Грибы используют как объекты в генной инженерии и других научных исследованиях.

Методы изучения морфологии грибов:

1.В неокрашенном состоянии, в "раздавленной капле" ее щёлочью.

 Щелочь растворяет жир и ороговевшие клетки, после чего можно рассмотреть структуру и элементы грибов в пораженных тканях.

2. В окрашенном состоянии в чистой культуре  (красят чаще простым способом).

3. В окрашенных и неокрашенных гистологических срезах.

4. В люминесцентном микроскопе  после обработки флюорохромами, используя вторичную люминесценцию.

Простейшие - это эукариоты, близкие к животным клеткам. Размеры от 4 до 200 мкм. Форма - округлая, овальная, полулунная, грушевидная и т.д. У некоторых простейших тело покрыто относительно тонкой мембраной  (амёба), у других - более плотной эластичной оболочкой - пелликулой (балантидии), у жгутиковых - перипластом (пелликула + слой продольных фибрилл). В цитоплазме располагаются I, иногда 2 ядра  (микро-и макровнуклеусы балантидий), полисомы, митохондрии, включения, вакуоли и др. У некоторых в цитоплазме лежит скелетная органелла - аксостиль. Отдельные простейшие имеют специальные органеллы: прикрепления (присоска у лямблий), проникновения (у токсоплазм), пищеварения (у балантидий).

Движение простейших осуществляется с помощью:

- псевдоподии  (амеба);

- жгутиков (лямблии)

- ресничек    (балантидии);

По типу питания - гетеротрофы. Среди них есть абсолютные паразиты  (плазмодии, токсоплазмы и др. В неблагоприятных условиях могут образовываться цисты - скопления из нескольких особей, покрытых общей оболочкой. По типу дыхания - большинство факультативные анаэробы.

Механизм питания:

1. Всей поверхностью тела по типу фагоцитоза и пиноцитоза (амеба).

2. Посредством специальных органелл пищеварения  (балантидии).

Простейшие чувствительны к дезинфицирующим растворам (цисты

более устойчивы). Для многих простейших характерна стадийность

развития, переход от одного хозяина к другому, причем в организме

определенных хозяев проходит половой цикл развития.

Размножение осуществляется:

- простым делением (амеба);

- множественным делением (шизогония у плазмодия);

- половым способом (конъюгация или копуляция).

- Классификация простейших:

1. Класс корненожек (возбудитель амебиаза др.).

В лекции "19. Описание импульсных систем с несколькими элементами" также много полезной информации.

2. Класс жгутиковых (возбудители трихомоноза, лямблиоза, лейшманиоза, сонной болезни и др.).

3. Класс споровиков (возбудители малярии, токсоплазмоза, криптоспоридиоза и др.).

4. Класс ресничные (возбудитель балантадиаза и др.).

Морфологию простейших изучают:

- в неокрашенном состоянии (в препарате "раздавленная капля из свежего материала на подогреваемом столике микроскопа).

- в окрашенных препаратах (по Романовскому-Гимзе и др.).